补阳还五汤对急性脊髓损伤模型大鼠神经细胞凋亡的影响

侯兆阳 陈 哲 魏家森

补阳还五汤对急性脊髓损伤模型大鼠神经细胞凋亡的影响

侯兆阳1陈 哲2魏家森1

目的观察补阳还五汤对大鼠急性脊髓损伤（ASCI）的治疗作用及其机制。方法SD大鼠随机分为空白组、损伤对照组、补阳还五汤组，各10只。采用Allen’s打击法建立急性脊髓损伤模型，空白组和损伤对照组造模后予蒸馏水1mL灌胃，补阳还五汤组造模后予补阳还五汤1mL灌胃，均1天1次，连续3天。各组分别于术后1、7、14天观察其行为学BBB评分，14天通过免疫组化的方法观察脊髓损伤部位神经细胞凋亡（caspase-3p20、Bcl-2与Bax）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平。结果①行为学观察评分：术后7、14天补阳还五汤组与损伤对照组下肢功能均有恢复（P＜0.05），且补阳还五汤组较损伤对照组恢复更明显［（9.05±0.95）分比（5.75±1.97）分，（12.6±1.55）分比（8.80±3.34）分，P＜0.05］。②免疫组化检测：补阳还五汤组 caspsase-3p20 阳性细胞数表达较损伤对照组少［（16.70±2.21）个比（20.30±4.13）个，P＜0.05］；补阳还五汤组 Bcl-2 阳性细胞的表达较损伤对照组增加［（10.57±0.97）个比（6.42±3.20）个，P＜0.05］；补阳还五汤组 Bax阳性细胞的表达较损伤对照组少［（18.29±2.21）个比（21.14±2.41）个，P＜0.05］；补阳还五汤组 VEGF 阳性细胞的表达较损伤对照组多［（11.75±1.03）个比（9.50±1.30）个，P＜0.05］。结论补阳还五汤可提高脊髓损伤部位VEGF的表达，使细胞凋亡明显减少，促进骨髓功能的恢复。

大鼠；脊髓损伤；补阳还五汤；细胞凋亡；VEGF

急性脊髓损伤（acute spinal cord injury，ASCI）是指脊髓遭受到外力打击后导致完全性或不完全性脊髓运动、感觉、括约肌功能障碍等，是脊柱外科领域中一种常见的、创伤性极大、后果极其严重的疾病[1]。如何采用更为有效的措施来降低该病的致残率并提高患者生活质量，已成为目前脊柱外科临床面临的主要课题之一。补阳还五汤为传统中药方剂，临床广泛用于坐骨神经痛、多发性神经炎、糖尿病周围神经病变以及冠心病、脑卒中等病症，疗效显著。本实验通过观察补阳还五汤对急性脊髓损伤神经细胞细胞凋亡的影响，初步观察其对ASCI的治疗作用。

1 实验材料

1.1 药品与试剂 补阳还五汤：按原方比例取生黄芪 120g，当归尾 6g，赤芍 4.5g，地龙、川芎、红花、桃仁各3g（购于浙江省新华医院）。制备方法：加水回流提取2次，第一次加10倍水提取2h，第二次加8倍水提取1.5h，药液过滤、合并浓缩至4g/mL，4℃保存。免疫组化试剂：caspase-3p20（批号 00980590）、Bcl-2（批号 20130224）、Bax（批号 20100701）、VEGF（批号

00980409）及相应一抗均购自于上海源叶生物制品公司，二抗由浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 仪 器 自制Allen’s打击器、OlympusB显微镜等。

1.3 实验动物 体质量200g左右健康SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（沪）2013-0016，在浙江中医药大学动物实验中心屏障系统中饲养。

2 实验方法

2.1 急性脊髓损伤模型建立 采用Allen’s打击法。大鼠以10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，俯卧位固定，背部备皮，常规消毒，以T10为中心，沿正中线做约3cm纵行切口，依次切开皮肤、皮下筋膜，暴露椎旁肌，钝性剥离肌肉暴露棘突、椎板和横突。咬除T10棘突及全椎板至椎弓根部，部分咬除T9和T11椎板，暴露待损伤脊髓长约10 mm充分暴露T10对应的脊髓。用自制改良的Allen’s撞击器制备脊髓损伤动物模型，将重10 g的圆柱状金属棒沿细玻璃导管从6 cm高度自由落体，撞击T10骨窗对应的脊髓，造成急性脊髓损伤，击打脊髓后，击打棒不动，停留3 min再移开。撞击成功标准为：撞击脊髓组织水肿、出血，硬脊膜完整呈紫红色，紧张，膨隆，大鼠尾巴出现痉挛性摆动，双下肢躯体回缩样扑动，呈迟缓性瘫痪。然后冲洗创口，逐层缝合椎旁肌肉和皮肤，肌注青霉素3天，同时每天挤压膀胱排尿两次以上，直至形成膀胱反射。

2.2 实验分组及给药 30只SD大鼠先按性别分两个区组并编号，后用随机数字分配到空白对照组、损伤对照组和补阳还五汤组，每组10只。空白对照组行棘突及全椎板切除，暴露脊髓，脊髓不损伤，术后蒸馏水1mL灌胃，连续3天；损伤对照组按Allen’s打击法进行造模，术后蒸馏水1mL灌胃，连续3天；补阳还五汤组按Allen’s打击法进行造模，造模成功后用制备好的补阳还五汤1mL，灌胃给药，连续3天。饲养过程中各组死亡大鼠，后续重新造模补充。

2.3 后肢运动神经功能观测指标 采用Basso、Beattie、Bresnahan（BBB）（1996 年）评分法[2]。分别于造模后1、7、14天测定，由熟悉该评分标准的非本组实验人员进行，观察大鼠脊髓功能恢复情况。

2.4 组织灌注及标本的制备 10%水合氯醛溶液3.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后暴露心脏，于右心房剪口放血，左心室剪口行主动脉插管，后用肝素盐水约150mL进行心脏灌注，随后用4%的甲醛溶液约150mL进行心脏灌注，灌注成功后，固定约0.5h取以T10脊髓为中心约2.5cm脊髓，置于4%甲醛溶液固定。固定的颈髓依次进行脱水、浸蜡、石蜡包埋，行横切面5μm厚度连续切片。

2.5 免疫组织化学染色 caspase-3p20、Bcl-2、Bax、VEGF的表达采用免疫组化二步法，具体操作按试剂盒说明书进行。标本进行免疫组化测定：阳性表达细胞的形态学观察（光镜×400）：在镜下主要表现为胞浆呈现棕黄色颗粒的神经元，其数量越多，色越深，表明调控基因表达量越多，反之亦然。

2.6 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，数据以均数±标准差（±s） 表示，多组间均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD方法。

3 实验结果

3.1 BBB评分 手术前所有大鼠行为评分均为21分。术后空白对照组评分一直为21分，损伤对照组和补阳还五汤组术后1天行为评分均为0分，即双下肢无活动，组间比较无统计学意义（P＞0.05）。7、14天损伤对照组和补阳还五汤组大鼠双下肢运动功能均得到一定程度的恢复（P＜0.05），补阳还五汤组较损伤对照组恢复更好（P＜0.05），见表1。

3.2 免疫组化结果 免疫组化显示，caspsase-3p20阳性细胞：补阳还五汤组表达较损伤对照组少（P＜0.05），较空白对照组多（P＜0.05），说明补阳还五汤抑制脊髓损伤后caspase-3p20表达的增加；Bcl-2阳性细胞：补阳还五汤组的表达较损伤对照组多（P＜0.05），较空白对照组少（P＜0.05），说明补阳还五汤可抑制脊髓损伤后Bcl-2表达的减少；Bax阳性细胞：补阳还五汤组的表达较空白对照组多（P＜0.05），较损伤对照组少（P＜0.05），说明补阳还五汤可抑制脊髓损伤后Bax表达的增加；VEGF阳性的细胞：补阳还五汤组表达较损伤对照组多（P＜0.05），较空白对照组少（P＜0.05），说明脊髓损伤后VEGF的表达减少，补阳还五汤可增加VEGF的表达。见表2。

表1 各组术后1、7、14天BBB评分比较（分，±s）

表1 各组术后1、7、14天BBB评分比较（分，±s）

注：与 1 天比较，△P＜0.05；与损伤对照组比较，☆P＜0.05

组别空白对照组损伤对照组补阳还五汤组只数10 10 10 1天21 0 0 7天21 5.75±1.97△9.05±0.95☆△14天21 8.80±3.34△12.6±1.55☆△

表 2 各组 caspase-3p20、Bcl-2、Bax、VEGF 阳性细胞数比较（个，±s）

表 2 各组 caspase-3p20、Bcl-2、Bax、VEGF 阳性细胞数比较（个，±s）

注：与空白对照组比较，☆P＜0.05；与损伤对照组比较，★P＜0.05

组别空白对照组损伤对照组补阳还五汤组只数10 10 10 caspase-3p20 7.30±3.16 20.30±4.13☆16.70±2.21☆★Bax 7.00±2.16 21.14±2.41☆18.29±2.21☆★Bcl-2 18.42±2.76 6.42±3.20☆10.57±0.97☆★VEGF 14.25±2.58 9.50±1.30☆11.75±1.03☆★

4 讨 论

ASCI可分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段[3]。原发性损伤是指脊髓损伤时，由于骨折的移位、脱位或椎间盘脱入椎管及骨折片等刺入脊髓，对脊髓造成的直接压迫、冲击、撕裂、挫裂及剪切伤等，引起神经细胞、轴突和血管的直接损伤；继发性损伤是指由于原发性损伤导致的受损局部缺血、神经生长因子缺乏、能量代谢紊乱、组织水肿等局部生化条件改变，从而引起的脊髓再损伤，其程度远远超过原发性损伤[4]。而这种局部内环境的改变可直接或间接导致神经细胞和神经胶质细胞的凋亡和坏死[5]。

1995年美国学者Crowe等[6]首次证实脊髓损伤后神经细胞存在凋亡现象。Li等[7]于1996年首次在大鼠SCI模型中发现存在大量神经细胞凋亡及相关基因Bcl-2的表达，Bcl-2是调节细胞程序性死亡的一个重要基因，Bax和Bcl-2具有同源性，具有促进细胞凋亡的作用，Bcl-2/Bax对细胞的凋比值是决定细胞凋亡的关键因素。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）是参与调节和执行凋亡最重要的蛋白酶之一，抑制其活性可以减少凋亡发生，在脊髓损伤中增加半胱氨酸蛋白酶的活性会导致神经组织退化[8]。有研究[9]表明：神经细胞凋亡是ASCI继发性损伤的主要形式，也是脊髓损伤后功能恢复不良的主要原因。损伤段凋亡现象主要发生在伤后24h；相邻节段凋亡高峰在72h，凋亡细胞绝对数量远远高于原发损伤段[10]，因此，ASCI后72h是治疗的关键时期。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种生物活性较强的血管生成肽，通过特异性地结合血管内皮生长因子受体，高度特异性地作用于血管内皮细胞，调节血管的生成和血管通透性等。VEGF在脊髓损伤过程具有神经保护，抑制神经细胞凋亡，促进神经细胞再生等作用[11]。

补阳还五汤由清代名医王清任所创，始见于《医林改错》，由黄芪、赤芍、当归、地龙、川芎、桃仁和红花组成，近年报道补阳还五汤在促进损伤神经再生修复等方面，有独特的效果[12]。

从本实验结果发现，脊髓损伤后经过一段时间补阳还五汤组与损伤对照组下肢功能均有恢复，补阳还五汤组较损伤对照组恢复更加明显；脊髓损伤后导致Caspase-3p20和Bax的表达增加，Bcl-2、VEGF的表达减少，神经细胞凋亡增加；补阳还五汤可使Caspase-3p20和Bax的表达减少，Bcl-2、VEGF的表达增加，神经细胞凋亡减少。

综上所述，补阳还五汤可能是通过增加VEGF的表达，从而抑制神经细胞的凋亡，减少脊髓损伤部位的继发性损伤，最终起到促进运动功能恢复的作用。实验表明补阳还五汤具有治疗脊髓损伤的潜力，但具体的作用机制还有待进一步研究。

［1］胥少汀，郭世绂.脊髓损伤基础与临床［M］.北京：人民卫生出版社，2002：193-194.

［2］ Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC，et al.Mascis evaluation of open field locomotor scores：effects of experience and teamwork on reliability［J］.Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study，1996，13（7）：343-359.

［3］Oyinbo CA.Secondary injury mechanisms in traumatic spinalcord injury：a nugget of this multiply cascade［J］.Acta Neurobiol Exp，2011，71（2）：281-299.

［4］ Gorio A，Gokmen N，Erbayraktar S，et al.Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma［J］.Proc Natl Acad Sci，2002，99（14）：9450-9455.

［5］Yakovlev AG，Faden AI.Caspase-dependent apoptotic pathways in CNS injury［J］.Mol Neurobiol，2001，24（1-3）：131-144.

［6］ Crowe MJ，Bresnahan JC，Shuman SL，et al.Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys［J］.Nat Med，1997，3（1）：73-76.

［7］ Li GL，Brodin G，Farooque M，et al.Apoptosis and expression of bcl-2 after Compression trauma to rat spinal cord［J］.J Neuropathal Neurol，1996，55（3）：280-289.

［8］ Ray SK，Hogan EL，Banik NL，et al.Calpain in the pathophysiology of spinal cord injury：neuroprotection with calpain inhibitors［J］.Brain Res Brain Res Rev，2003，42（2）：169-185

［9］ Liu G，Keeler BE，Zhukareva V，et al.Cycling exercise affects the expression of apoptosis-associated microRNAs after spinal cord injury in rat［J］.Exp Neurol，2010，226（1）：200-206.

［10］傅强，侯铁胜，李明，等.脊髓急性损伤后神经细胞凋亡的时相和空间分布特点［J］.颈腰痛杂志，2001，22（3）：199-201.

［11］ Tolosa L，Mir M，Olmos G，et al.Vascular endothelial growth factor protects motoneurons from serum deprivation induced cell death through phosphatidylinositol 3-kinasemediatied p38 mitogen-activated protein kinase inhibition［J］.Neurosicence，2009，158（4）：1348-1355.

［12］徐绍东.补阳还五汤药浴对大鼠周围神经损伤再生影响的实验研究［J］.福建中医学院学报，2008，18（4）：40.

（收稿：2014-04-29 修回：2014-07-28）

Effects of Buyang Huanwu Decoction on Neural Cell Apoptosis after Acute Spinal Cord Injury in Rats

HOU Zhaoyang1，CHEN Zhe2，WEI Jiasen1.1 Second Clinical Collegeof Zhejiang ChineseMedical University,Hangzhou（310053）,China;2 Department of Spinal Surgery,Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou（310000）,China

Objective To determine the therapeutic efficacy of Buyang Huanwu Decoction（BYHWD）in the treatment of acute spinal cord injury（ASCI） in rats,and to investigate the underlying mechanism.MethodsThirty SD rats were randomized into control group（laminectomy only）,ASCI group,ASCI+BYHWD group,10 rats in each group.ASCI was induced by using the modified weight-drop method in the latter two groups.Rats in control and ASCI groups were intragastrically given distilled water once daily for 3d，rats in ASCI+BYHWD group were given BYHWD for the same period.Locomotors functional recovery was assessed on day 1，7，14 after operation by performing open-field locomotors tests（BBB score）.On postoperative day 14，the segments of spinal cord encompassing the injury site were removed for histopathological analysis.Immunohistochemistry was performed to observe the expression of B-cell CLL/lymphoma-2（Bcl-2），BCL-2-associated X protein（Bax），caspase-3，and vascular endothelial growth factor（VEGF）.ResultsBoth of the BYHWD-treated rats and ASCI rats had locomotor function recovery on postoperative day 7 and 14（P＜0.05），but the BYHWD-treated rats had significantly better locomotor function recovery than ASCI group did（D7：9.05±0.95 vs 5.75±1.97；D14：12.60±1.55 vs 8.80±3.34；all P＜0.05）.Compared with ASCI group，the BYHWD-treated rats had reduced expression of caspase-3（16.70±2.21 vs 20.30±4.13，P＜0.05）and Bax（18.29±2.21 vs 21.14±2.41，P＜0.05），increased expression of Bcl-2（10.57±0.97 vs 6.42±3.20，P＜0.05）and VEGF（11.75±1.03 vs 9.50±1.30，P＜0.05）.ConclusionBYHWD treatment after ASCI can significantly improve locomotor recovery by upregulating VEGF and inhibiting neural apoptosis.

rats;spinal cord injury；Buyang Huanwu Decoction；Apoptosis；VEGF

p

浙江省中医药科技计划项目（No.2010ZB049）；浙江省教育厅科研项目（No.Y200906743）

1浙江中医药大学第二临床学院（杭州 310053）；2浙江中医药大学附属第二医院脊柱外科（杭州 310000）

陈哲，Tel：18958013615；E-mail：cz6851@sina.com