山银花多糖提取工艺参数优化

杨申明　王振吉　谢启明

摘要：采用苯酚-硫酸法测定山银花（Lonicera hypoglauca）多糖的含量，并对提取工艺进行优化。在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验，以山银花多糖提取率为指标，探讨了提取次数、提取温度、提取时间、料液比对山银花多糖提取率的影响。结果表明，最佳提取工艺参数为提取4次、提取温度80 ℃、提取时间150 min、料液比1∶20（g∶mL）。在此条件下，山银花中多糖平均提取率为15.39%，加样回收率为97.70%，该方法提取山银花多糖操作简便、准确度高、重现性好，可作为山银花多糖提取和含量测定的方法。

关键词：山银花（Lonicera hypoglauca）；多糖；苯酚-硫酸法；正交试验

中图分类号：S567.1+9；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）10-2466-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.043

山银花（Lonicera hypoglauca）别名大银花、金因花（哈尼族名）、棒早瓜（苗族名），为忍冬科菰腺忍冬干燥的花蕾或带初开的花[1]。它味甘、性寒，是临床中常用中药，药用价值很高，具有清热解毒、疏散风热的功效，常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发病等。山银花在中国资源丰富，分布于全国各省，它具有抗病原微生物、抗炎、抗氧化、保肝、抗肿瘤、免疫调节与抗动脉粥样硬化等方面的活性，在民间使用较为广泛，是多种中成药的主要原料。近年来，山银花还被广泛应用于食品、饮料、保健品、化妆品和兽医用等方面。据文献报道，山银花的化学成分主要有挥发油类、黄酮类、有机酸类和苷类等[2]。

多糖（Polysaccharide）是由许多相同或不同的单糖以糖苷键聚合而成的高分子化合物，它是自然界中储量丰富的生物聚合物，主要包括植物多糖、动物多糖以及微生物多糖3类[3]。植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗衰老、抗疲劳以及抗凝血、抗炎、抗菌、抗惊厥、镇静、止喘及降血压等[4-8]多种生物活性及药理作用，很可能是山银花免疫调节和抗癌抗肿瘤的有效成分之一。目前，有关山银花多糖含量测定及提取工艺研究尚未见报道。试验采用水提醇沉法对山银花中多糖进行提取，通过有关显色反应对提取物进行定性鉴定，用苯酚-硫酸法测定其多糖含量，通过正交试验对提取工艺进行了优化，旨在为山银花的药学价值研究提供参考并为其进一步开发利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山银花采自云南省双柏县衰牢山，经鉴定为忍冬科植物；葡萄糖标准品（≥98%）、石油醚（沸程30～60 ℃）、三氯乙酸、95%乙醇、苯酚、蒽酮、α-萘酚、浓硫酸等均为分析纯。

722S型分光光度计（上海青华科技仪器有限公司）、HH-S2s型恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）、电子天平（奥豪斯仪器）、12B5型台秤（成都天平仪器厂）、SHZ-ⅢA型循环水真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）、远红外快速恒温干燥箱（鄄城威瑞科教仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验材料处理 样品依次用自来水、去离子水洗净风干后放入远红外快速恒温（55 ℃）干燥箱中烘干，粉碎后过40目筛，得山银花干粉。将山银花干粉用折叠成筒状的滤纸装好置于索式提取器中，加入石油醚冷浸48 h，然后置于75 ℃水浴中，使其微沸回流反复提取，直至提取液澄清为止，取出冷却至室温。用减压抽滤，滤渣用石油醚充分洗涤后，风干至石油醚全部挥发，得到去除色素和油脂的山银花，烘干后密封保存，备用。

1.2.2 山银花多糖的提取 准确称取去除色素和油脂的山银花干粉5.00 g，置于250 mL烧杯中，加入125 mL去离子水，置于80 ℃恒温水浴锅中加热120 min后。减压抽滤，浓缩滤液，往滤液中加入等体积的3%三氯乙酸除去山银花中的蛋白质，摇匀、静置过夜，离心除去沉淀，再往滤液中加入4倍体积的95%乙醇沉淀多糖，静置24 h，将醇沉后的白色絮状物进行离心，得山银花多糖粗提物，用去离子水溶解多糖粗提物，得供试品溶液，备用。

1.2.3 山银花多糖的鉴定 取2 mL供试品溶液3份，分别加质量分数为5%苯酚溶液1 mL和硫酸溶液2 mL，浓度为2 g/mL蒽酮-硫酸溶液4 mL，质量分数为0.5% α-萘酚溶液1 mL和浓硫酸溶液2 mL，进行显色反应，观察试验现象，检验有无多糖[9，10]。

1.2.4 山银花多糖含量测定

1）葡萄糖标准溶液的制备。准确称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品100.00 mg，用去离子水溶解摇匀，并定容至100 mL容量瓶中，得浓度为1.00 mg/mL的葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分别置于7个100 mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，再从上述容量瓶中分别移取4.0 mL溶液放入比色管中，再分别加入5%苯酚1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，摇匀，置于35 ℃恒温水浴锅中加热40 min，冷却至室温，以去离子水作空白对照，在490 nm波长处测吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖标准溶液浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，建立回归方程[11]。

2）多糖提取率的计算。将所得山银花多糖全部转移至100 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，再从100 mL容量瓶中移取1.0 mL溶液，置于100 mL容量瓶，加入去离子水定容，混均，再吸取4.0 mL已混匀的溶液，按标准曲线绘制方法测其吸光度。将所得吸光度代入线性回归方程得到样品稀释后的浓度，将其值代入下式方程即可以求出多糖提取率：

多糖提取率=样品溶液浓度×稀释倍数×总体积/样品质量×100%

1.2.5 单因素试验 按照上述提取方法，分别考察以下单因素的影响[12-14]：提取次数（1、2、3、4、5）、提取温度（60、70、80、90、100 ℃）、提取时间（60、90、120、150、180 min）、料液比（g∶mL，下同）（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）。

1.2.6 正交试验设计 在单因素试验的基础上，选择提取次数、提取温度、提取时间、料液比为试验因素，每个因素取3个水平，以多糖提取率为评价指标，设计L9（34）正交试验研究最佳工艺条件。因素与水平见表1。根据正交试验的结果，在最佳提取工艺参数条件下测定山银花的精密度和加标回收率。

2 结果与分析

2.1 多糖的定性鉴定

显色反应结果见表2。由表2可知，山银花中含有多糖类化合物。

2.2 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图1。由图1可知，葡萄糖浓度在0.0～35.0 μg/mL内线性关系良好，其回归线方程为A=0.001 08+0.013 24C，R=0.999 78。

2.3 单因素试验结果

提取次数对多糖提取率的影响见图2a。由图2a可知，开始时随提取次数的增多，多糖的提取率增大，当提取次数达3以后，多糖提取率变化不大，故试验选择提次数为2～4用于下一步优化试验。提取温度对多糖提取率的影响见图2b。由图2b可知，开始时随着提取温度的升高，多糖的提取率升高，当提取温度升高到80 ℃时，提取率最高，之后随提取温度的增加，多糖提取率呈下降趋势，故选择提取温度为70～90 ℃用于下一步优化试验。提取时间对多糖提取率的影响见图2c。由图2c可知，开始时随着提取时间的延长，多糖的提取率升高，当提取时间延长到120 min时，提取率最高，之后随提取时间的延长，多糖提取率呈下降趋势，故选择提取时间为90～150 min用于下一步优化试验。料液比对多糖提取率的影响见图2d。由图2d可知，开始时随溶剂的增加，多糖提取率升高，当料液比为1∶25时提取率最高，之后随着溶剂的进一步的增加，多糖提取率呈下降趋势，故选择料液比为1∶20～1∶30用于下一步优化试验。

2.4 正交试验结果

正交试验结果见表3。由表3可知，各因素对山银花多糖提取率的影响主次顺序为：A>B>D>C，即提取次数>提取温度>料液比>提取时间，最佳组合为A3B2C3D1，最佳提取工艺参数为提取4次、提取温度80 ℃、提取时间150 min、料液比1∶20。在此条件下进行重复性试验，测得山银花中多糖平均提取率为15.39%，RSD为0.27%（n=5），表明该方法重现性好。加标回收率为97.70%，RSD为1.42%，表明该方法对山银花多糖提取测量的准确度较高。

3 小结与讨论

由热水法提取得到的粗多糖中常含有蛋白质，常用的去蛋白质方法有Sevag法、三氯乙酸沉淀法和蛋白酶水解法、鞣酸法等，本试验采用三氯乙酸沉淀法去除山银花多糖中的蛋白质。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，为避免苯酚氧化，苯酚试剂要现用现配，由于硫酸密度比水大，容易分层，因此样品加入苯酚试剂后和紫外测定前一定要振摇充分。

本研究结果表明，山银花中富含多糖化合物，各因素对山银花多糖提取率的影响程度不同，在趋于提取平衡的条件下，其影响的主次顺序为提取次数>提取温度>料液比>提取时间。优化后的最佳提取工艺参数为提取4次、提取温度80 ℃、提取时间150 min、料液比1∶20，在此条件下测得山银花多糖平均提取率为15.39%，RSD为0.27%（n=5），加标回收率为97.70%，该方法测定山银花多糖含量，可获得良好的线性关系（R=0.999 78），而且重现性试验、回收率试验均符合分析要求，方法准确，可用于山银花中多糖的提取和含量测定。

目前，对山银花化学成分与药理作用等方面研究相对较少，并且主要集中在绿原酸的研究方面， 对山银花的其他活性成分及其药理作用机理、临床应用等有待进一步的研究探索。本试验首次对山银花多糖的测定方法和提取工艺参数进行了初步研究，但山银花多糖的组成、结构、药理药效作用还需要更进一步的研究。

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