持续低流量复灌注对兔睾丸不全扭转细胞凋亡的影响

郭晶晶 俞丽云 黄 美 梁荣喜 陈 舜 何以敉 薛恩生福建医科大学附属协和临床学院，福建医科大学附属协和医院超声科，福建省超声医学研究所（福州 350001）

持续低流量复灌注对兔睾丸不全扭转细胞凋亡的影响

郭晶晶 俞丽云 黄 美 梁荣喜 陈 舜 何以敉 薛恩生*
福建医科大学附属协和临床学院，福建医科大学附属协和医院超声科，福建省超声医学研究所（福州 350001）

摘要目的 研究持续性低流量复灌注对睾丸不全扭转细胞凋亡的保护作用。方法 实验分为轻度睾丸缺血组（A组）和中度睾丸缺血组（B组），两组各分为对照组（分别为AS组和BS组）和后处理组（A1和B1为45s维持组，A2和B2为45s渐增组，A3和B3为30s维持组，A4和B4为30s渐增组）。对照组进行直接复灌注，A1、B1组及A3、B3组分别进行45s和30s的维持相同的低流量复灌注，A2、B2组及A4、B4组分别进行45s和30s的渐增加的低流量复灌注。缺血前与术后3d进行睾丸超声造影，并检测睾丸组织Bcl-2相关X蛋白（Bax）、胱门蛋白酶-3 （caspase-3）、凋亡指数（AI）。结果 术后3d超声造影与缺血前比较，A4组及B4组的始增时间（AT）、达峰时间（TTP）、峰值强度（PI）、峰值基础强度差（PBD）差异比较均无统计学意义（P＞0.05）；峰值减半时间（DT/2）缩短，差异具统计学意义（P＜0.05）。45s渐增组和30s组的AI明显低于对照组和45s维持组（P＜0.01）。30s组Bax和caspase-3均显著低于对照组（P＜0.01）。结论 持续低流量复灌注对兔轻、中度睾丸不全扭转具有不同程度的保护作用，保护效果与复灌持续时间和血流增幅有关，以30s渐增低流量复灌保护作用最显著。

关键词再灌注; 精索扭转; 细胞凋亡

睾丸扭转是泌尿外科常见的阴囊急症，可引起睾丸组织缺血缺氧并造成生精细胞凋亡，故应当尽早恢复血供以避免长时间缺血造成组织坏死，而一次性完全恢复组织血供将引起缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury, IRI）。张国明等[1]证实渐进后处理较间隔缺血后处理更能有效减轻鼠缺血心肌的IRI，但张国明的渐进后处理有再次缺血环节，可能对组织造成“二次损伤”，本实验拟改良渐进后处理模式为可控持续性低流量复灌注，通过观察超声造影、生精细胞凋亡指数（AI）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和胱门蛋白酶-3 （caspase-3）等指标，研究进行持续性低流量复灌注能否对睾丸不全扭转细胞凋亡产生保护作用。

材料与方法

一、实验动物

76只健康雄性大白兔，体质量2.0～3.3kg，平均体质量为（2.45±0.16）kg，兔龄17.1～22.6周[（19.7± 1.3）周]，许可证号：SCXR-2008-0002。本动物实验按照国家《实验动物管理条例》和《福建省实验动物管理条例实施细则》执行。

二、仪器与方法

（一）仪器与试剂

Acuson sequoia-512彩色多普勒超声诊断仪，15L8W线阵变频探头，选择小器官睾丸模式，灰阶频率8.0 MHz～14.0MHz，彩色频率7.0 MHz ～14.0MHz，彩色血流量程调至0.9cm/s。Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件，Syngo US Workplace超声造影分析软件。SonoVue超声造影剂（意大利Bracco公司），戊巴比妥钠（上海源叶生物科技有限公司），兔抗兔Bax一抗（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗兔caspase-3一抗（北京百迈客生物技术有限公司），KGA7022原位细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物发展有限公司）等。

（二）动物模型

3%戊巴比妥钠溶液按1mL/kg对大白兔进行耳缘静脉麻醉并置留置针。随机选择一侧睾丸，暴露精索结构，在距睾丸上极约1cm处用蛙心管夹对精索进行不全钳夹，在彩色多普勒超声监测下，使睾丸内彩色血流信号面积减少至钳夹前的50%，制成睾丸血运障碍模型，钳夹后连续动态观察。当睾丸血流信号减少至钳夹前的20%～30%时，轻度缺血模型建立成功。当睾丸血流信号减少至钳夹前的5%～10%时，中度缺血模型建立成功[2]。

（三）实验分组与方法

76只大白兔随机分为轻度缺血组（A组，38只）和中度缺血组（B组，38只），依前述方法建立不同缺血程度的睾丸扭转模型。A、B组各分为对照组（AS组和BS组，每组6只）和后处理组（A1和B1为45s维持组，A2和B2为45s渐增组，A3和B3为30s维持组，A4和B4为30s渐增组，每组8只）。成功建立模型后，对照组进行直接复灌注（100%），后处理组通过旋转蛙心管夹螺帽进行不同低流量（25%、50%、75%）复灌注后处理，A1、B1组及A3、B3组各维持45s和30s的25%的血流灌注量后，再完全复灌注。A2、B2组及A4、B4组分别进行45s和30s的逐渐增加血流量的灌注后，再完全复灌注，见图1。术后各组动物分笼饲养，3d后进行超声造影并取材检验。

图1 实验分组与低流量复灌注后处理方式示意图

（四）标本的检测

术后3d取约300mg患侧睾丸组织各2份液氮速冻保存，用Western blot法检测Bax和caspase-3，剩余组织用10%中性福尔马林缓冲溶液固定24h后行原位细胞凋亡检测计数AI。

（五）超声造影

于缺血前、再灌注前及术后3d分别进行双侧睾丸超声造影检查，设置造影频率7 MHz，造影增益0dB，机械指数、热力指数0.1，取双侧睾丸最大横切面，以0.1mL/kg剂量从耳缘静脉团注超声造影剂，对双侧睾丸造影图像进行录影，动态观察睾丸内造影剂充盈情况。造影录像用Syngo US Workplace超声造影分析软件得出时间-强度曲线（time-intensity urve，TIC），并对比分析患侧睾丸不同阶段的超声造影参数：始增时间（arrival time，AT）、达峰时间（time to peak，TTP）、峰值强度（intensity to eak，PI）、峰值基础强度差（peak-base intensity ifference，PBD）、峰值减半时间（DT/2）。

三、实验数据处理

采用SPSS 11.5软件行正态性检验及Lenven方差齐性检验后采用单因素方差分析，如P＜0.05则再进行多个均数间的多重比较（least significant difference，LSD检验）。以双侧P＜0.05为差别有统计学意义，P＜0.01为差别有显著统计学意义。

结 果

一、双侧睾丸超声造影

缺血前造影见造影剂向心性强化，各参数组间比较均无差异（P＞0.05）。再灌注前造影见AT、TTP、DT/2显著延长，PI、PBD明显降低（P＜0.01），TIC呈“慢进慢退”型，见图2。术后3d与缺血前比较，A4组及B4组的AT、TTP、PI、PBD无差异（P＞0.05），DT/2缩短（P＜0.05），各组数据见图3。

图2 缺血前、再灌注前及术后3d3d双侧睾丸TICTIC

图3 术后3d, A3d, A、B组各造影参数结果箱式图

二、术后3d患侧睾丸凋亡指数

A组中各后处理组AI均明显低于AS组（P＜0.01），且A2、A3、A4组AI明显低于A1组（P＜0.01）；B组中各后处理组AI较BS组均显著降低（P＜0.01），且B2、B3、B4组AI明显低于B1组（P＜0.01），其中以B4组最低，见图4、表1。

图4 术后33dd,, 患侧睾丸生精细胞凋亡光镜图（×200）

表1 术后3d, 3d, 患侧睾丸生精细胞凋亡指数(%%)

三、术后3d3d患侧睾丸BaxBax和caspase-3ase-3蛋白相对含量

A、B组中3、4组的B a x均显著低于对照组（P＜0.01）；A、B组中各后处理组caspase-3均显著低于对照组（P＜0.01），且3、4组低于1、2组（P＜0.05），见图5、表2。

图5 术后3d, 3d, 患侧睾丸BaxBax和caspase-3ase-3蛋白印迹条带

表2 术后3d, 3d, 患侧睾丸BaxBax和caspase-3ase-3蛋白相对含量（x±sxs）

讨 论

精索不全扭转可造成睾丸血供部分受阻，导致睾丸实质内微循环障碍，超声造影能够反映其血流动力学变化。Akçora等[3]发现渐处理能够对抗轻、中度缺血睾丸组织的再灌注损伤，但低流量的渐处理对缺血睾丸组织血流动力学的影响及原理并未得到阐明。麻日虎等[4]在研究渐处理对肺IRI的影响过程中发现，肺组织的IRI主要为血管内皮细胞损伤，直接复灌注可造成血管通透性和血管阻力增加。低流量的渐进后处理可以通过低压力的血流复灌，避免直接完全开放精索血供时，因灌注压骤然升高造成的血管内皮急剧扩张、血管舒缩功能受损[5-7]。本实验运用超声造影评价低流量后处理对缺血睾丸组织的保护效果，发现30s渐增组的AT、TTP、PI、BD与缺血前比较无差异，表明血流增幅适中的低压复灌注确能避免高压复灌对血管内皮的不良影响，降低血管通透性，减少液体外渗，减轻组织水肿对微血管的压迫[6]，使微血管状态最为接近缺血前正常情况，并畅通内循环，使造影剂迅速廓清，缩短DT/2为组内最低。

陈谦谦等[2]应用间隔缺血后处理减轻睾丸IRI的实验发现，不同复灌/停灌时间的缺血后处理保护效应不同。本实验结果显示，与对照组和45s维持组相较，在复灌即刻给予30s低流量后处理和45s渐增低流量后处理，对生精小管结构恢复更加有利，AI降低更为明显，表明对睾丸IRI的保护作用不仅与后处理时间有关，而且与后处理方式也存在一定关系。

本组实验显示无论在轻度缺血组还是中度缺血组中，30s组的促凋亡蛋白Bax和caspase-3均显著低于对照组。正常状态下细胞即存在凋亡现象，这种生理性的细胞凋亡处于动态平衡中，对组织更新等存在积极意义。当组织缺血时，促凋亡蛋白被大量合成并释放，使细胞凋亡失平衡。睾丸缺血后直接复灌注因完全开放血供、大幅增加组织供氧量，可引起氧自由基（reactive oxygen pecies，ROS）堆积、钙超载、脂质过氧化等一系列反应[8-11]，促使大量促凋亡蛋白Bax释放入胞浆插入线粒体膜内引起细胞色素C（Cytochrome

，Cyt C）释放[12-14]。Cyt C释放并激活caspase-3等引起瀑布式级联反应，并最终加剧各级生精细胞凋亡。30s低流量后处理通过控制复灌注的血流量，持续性适量供应氧化底物，缓和氧化应激反应，使产生的ROS始终维持在能够被清除的范围内，减轻其对生精细胞膜结构的损伤，削弱再灌注过程中产生的ROS对各级精母细胞分裂增殖活动的影响[15-17]，从源头控制生精细胞凋亡的发生，降低睾丸组织促凋亡蛋白Bax和caspase-3的产生，保护精原细胞，保证产生精子的数量和质量[18]。

另外，30s组产生的caspase-3低于45s组，说明除了通过低流量复灌注限制氧化底物的供应来减少促凋亡蛋白产生外，在何时完成后处理，进行完全复灌注对促凋亡蛋白产生同样重要。有研究发现用ATP对兔缺血心肌进行后处理，细胞凋亡率明显减低[19, 20]，但具体作用途径尚不明确。我们推测30s组较45s组更早完全开放复灌血流，氧等物质供应的适时增多，可能加强了生精细胞线粒体有氧呼吸，使ATP产量增加，降低了caspase-3的产生，从而减轻细胞凋亡。

本实验证明持续低流量复灌注对兔轻、中度缺血睾丸细胞凋亡具有一定的保护作用，低流量复灌注的方式和持续时间不同保护效果有所差异，将复灌持续时间结合血流量增幅可能寻找到低流量后处理的最佳模式，如本组中30s渐增低流量复灌注。但睾丸扭转低流量复灌所需的具体灌注压范围、含氧量多少仍需进一步研究，该方法是否优于复灌/缺血间隔后处理对睾丸扭转的保护作用也需进一步探讨。

参 考 文 献

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3 Akçora B, Altuğ ME, Balci A, et al. Gradual detorsion of torsioned rat testis attenuates ischemia reperfusion injury. J Pediatr Surg 2008; 43(10): 1879-1884

4 麻日虎, 李莹, 王玉旋, 等. “渐处理”对肺缺血再灌注损伤的保护作用. 中国医药导报 2012; 9(35): 38-40

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（2014-07-30收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.005

中图分类号R 697.24

*通讯作者, E-mail: xuees31@126.com

Effects of lasted low fl ow reperfusion postconditioning to incomplete testicular torsion in rabbit

Guo Jingjing, Yu Liyun, Huang Mei, Liang Rongxi, Chen Shun, He Yimi, Xue Ensheng*
Clinical Academy, Union Hospital of Fujian Medical University/Department of Ultrasound, Union Hospital of Fujian Medical University/Fujian Provincial Institute of Ultrasonic Medicine, Fuzhou 350001, China
Corresponding author: Xue Ensheng, E-mail: xuees31@126.com

AbstractObjective Explore the protective effects of lasted low fl ow reperfusion postconditioning to incomplete testicular torsion apoptosis. Methodsthods The experiment was randomly divided into mild ischemia group(A) and moderate ischemia group (B), and each group was divided into control groups (AS, BS) and postconditioning groups (A1, A2, A3, A4 and B1、B2、B3、B4). The control groups got reperfusion completely and immediately, groups A1, B1 and groups A3, B3 got same lasted low flow reperfusion with 45s and 30s, groups A2, B2 and groups A4, B4 got lasted gradually increasing low fl ow reperfusion with 45s and 30s. Got CEUS appearances before ischemia and postoperation, and analyzed the Bax, caspase-3 and AI of the affected testicle. Resultssults Compared the postoperative parameters with preoperation, the AT, TTP, PI, PBD of the groups A4 and B4 had no change (P＞0.05), the DT/2 were shorten(P＜0.05). The AI of groups 2, 3, 4 were signifi cantly lower than control group and group 1(P＜0.01). The Bax and caspase-3 of postconditioning groups with30s were signifi cantly lower than control groups (P＜0.01). Conclusionusion The lasted low fl ow reperfusion postconditioning has different protective effects to mild and moderate incomplete testicular torsion in rabbit, and the effect relates to the lasted time of reperfusion and the bloodfl ow growth, while the effect of lasted gradually increasing low fl ow reperfusion postconditioning with 30s is the most signifi cant.

Key wordsords reperfusion; Spermatic Cord torsion; apoptosis