几株乳酸菌对干红葡萄酒挥发性成分的影响

周安玲,米 兰,李霁昕,蒋玉梅

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

几株乳酸菌对干红葡萄酒挥发性成分的影响

周安玲,米 兰,李霁昕,蒋玉梅*

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

以完成酒精发酵的干红葡萄酒为原料,选用实验筛选的4株乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵(Malolactic fermentation,MLF),以未进行MLF的试样为对照,采用顶空固相微萃取、气相色谱-质谱(HS-SPME-GC/MS)联用技术分析试样挥发性组分。结果显示,4个试样中共检出70种挥发性组分,其中酒样C5检出42种,N8检出46种,N9检出46种,N13检出48种。CK检出35种,MLF试样挥发性物质种类及挥发量均较对照多,表明MLF过程中有新的挥发性组分形成,对葡萄酒香气品质有修饰作用。4种乳酸菌中,筛自泡菜的C5菌株(Lactobacillus plantarum)用于MLF后酒样酯类组分最高,相对含量达56.48%,酸类最低,占1.23%,酒样挥发性组分构成优于其它菌株。

乳酸菌,挥发性化合物,苹果酸-乳酸发酵,顶空固相微萃取,气相色谱-质谱联用

葡萄酒是以新鲜葡萄或葡萄汁为原料,经过部分或全部发酵酿制而成,具有一定酒精度的发酵产品。香气是评价葡萄酒品质最为重要的指标之一[1],葡萄酒的酿造过程酵母菌、乳酸菌等微生物代谢使得葡萄酒产品香气表现得复杂和多样[2]。目前已从葡萄酒中分离鉴定出约有800多种挥发性成分,主要包括醇、酯、有机酸、挥发性酚、内酯、缩醛、芳香酮、萜烯类、脂肪酸、单萜醇氧化物等[3-5],共同作用形成了葡萄酒产品独特的香气风格和特色。

苹果酸乳酸发酵(Malolactic fermentation,MLF)是葡萄酒在乳酸细菌作用下将苹果酸分解成乳酸和二氧化碳的过程,具有生物降酸、增加葡萄酒中微生物稳定性和改善葡萄酒香气,降低粗糙感,使之柔和、圆润的作用。对提高葡萄酒的感官质量,改善葡萄酒风味有重要影响。

国内外对于葡萄及葡萄酒挥发性组分进行了大量的研究,但大多主要集中在葡萄酒中挥发性组分分类、感官阈值分析[6-7]、合成途径与代谢机理研究[8],及葡萄酒挥发性组分释放影响因素的研究[9-12]。关于MLF对葡萄酒挥发性组分的影响研究目前鲜见报道,Henick-Kling T认为MLF可以改变葡萄酒中的水果香气,产生新的活性香气成分,从而影响了原有的香气平衡[13]。能进行葡萄酒乳酸发酵的细菌是乳酸菌的一些特殊的种,主要分属于酒球菌属(Oenococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳杆菌属(Lactobacillus)和片球菌属(Pediococcus)等,不同种的苹果酸-乳酸菌酿酒特性不同,但目前不同乳酸菌MLF对香气成分的影响研究较少。

本实验以酒精发酵结束后的赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、蛇龙珠(Cabernet Gernischet)、品丽珠(Cabernet franc)酿造的混合干红葡萄酒为原料,选用实验筛选的4株乳酸菌(菌株编号分别为C5(Lactobacillusplantarum)、N8、N9、N13(LactobacillusBeijerinck)分别对其进行苹果酸乳酸发酵(Malolactic fermentation,MLF),以未进行苹果酸乳酸发酵的试样为对照,采用顶空固相微萃取、气相色谱-质谱(HS-SPME-GC/MS)联用技术,分析4种不同菌株MLF后,葡萄酒香气构成的变化,比较所筛菌中对葡萄酒香气品质的影响确定与葡萄酒香气品质呈正相关的菌种,为葡萄酒MLF专用优良乳酸菌菌株筛选及葡萄酒生产提供科学数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赤霞珠(Cabernet Sauvignon)、蛇龙珠(Cabernet Gernischet)、品丽珠(Cabernet Franc)葡萄 2013年10月采于甘肃农业大学葡萄园;商品酿酒酵母:红佳酿Vintage Red(VR) 意大利Enartis公司;乳酸菌:C5 筛选自泡菜的植物乳杆菌株(Lactobacillus plantarum);N8、N9、N13 筛选自酸奶中的乳杆菌(Lactobacillus Beijerinck);果胶酶(Ex.color) 酶活力40000UPTE/mL,法国Lallemand公司。

SYQ-DSX-280B手提式不锈钢压力蒸气灭菌锅 上海中安医疗器械厂;SPX-150-Ⅱ生化培养箱 上海跃进医疗器械有限公司;SSW-CJ-1FD净化工作台 上海跃进医疗器械有限公司;CP214型电子天平 奥豪斯仪器有限公司制造;HH-S型恒温水浴锅 金坛市恒丰仪器制造有限公司;气相色谱-质谱联用仪(GC型号TRACE 1310,MS型号ISQ) Thermo Scientific,USA;顶空固相微萃取器(DVB/Carboxen/PDMS(50/30 μm) SUPELCO,USA;色谱柱DB-WAXETR 60 m×0.25 mm×0.25 μm,thermo,USA。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 酒精发酵:参照干红葡萄酒的一般生产工艺流程酿造[14],赤霞珠、蛇龙珠、品丽珠除梗破碎按比例10∶33∶16混合,装入10 L的棕色瓶,添加120 mg/L偏重亚硫酸钾和20 mg/L果胶酶浸渍24 h,加入0.2 g/L活化好的红佳酿酵母25 ℃发酵发酵7 d,残糖<4 g/L,完成酒精发酵。

MLF:纱布过滤进行皮渣分离制得原料酒样分装到15个250 mL的棕色瓶中,接入实验选用4株乳酸菌,每株菌做3个平行实验,乳酸菌参照文献[15]活化,接种量约为1×107CFU/mL。于生化培养箱20 ℃发酵,每隔2 d以纸层析方法检测苹果酸、乳酸[16]。发酵12～18 d后MLF结束。酒样品分别以菌株标号C5、N8、N9、N13表示,以未进行乳酸发酵样品为对照(CK)。

供试样品常规理化指标:还原糖、酒精度、FSO2和TSO2含量、干浸出物含量、滴定酸含量、pH和挥发酸含量等,检测结果均符合国家葡萄酒产品标准(GB15037-2006)。

1.2.2 挥发性成分提取 准确量取实验样品5 mL于样品顶空瓶中,加1.00 g NaCl和磁力搅拌子密封,250 ℃下老化1 h的固相微萃取头于40 ℃下顶空吸附30 min,萃取结束插入GC-MS进样口,250 ℃解析10 min进样分析。

1.2.3 GC-MS条件分析 色谱条件:进样口温度230 ℃;载气为He;流速1 mL/min;不分流进样,15 min后打开分流阀,分流比20∶1;程序升温:初温60 ℃,2 ℃/min至170 ℃,5 ℃/min至230 ℃(10 min)。

质谱条件:连接杆温度230 ℃;离子源为EI源(70 eV),离子源温度:250 ℃,质量扫描范围50～450 m/z。

1.2.4 数据处理 相对含量:峰面积归一化法,扣除峰面积小于100或无法定性的杂质峰计算总峰面积,组分相对含量(%)=各物质离子流图峰面积/总峰面积×100。

定性分析:由GC-MS分析得到的质谱数据参考文献资料[17-19]经计算机检索NIST2011、Wiley及香精香料标准谱库对分离挥发性物质进行初步定性。

2 结果与分析

2.1 样品挥发性物质初步定性分析

固相微萃取结合GC-MS技术分析试样及对照挥发性成分显示,MLF试样及对照试样挥发性物质的出峰时间主要集中在5 min到75 min(图1～图5)。

图1 C5乳酸菌苹乳发酵试样总离子流图Fig.1 Total iron chromatograms of C5 sample

图2 N8乳酸菌苹乳发酵试样总离子流图Fig.2 Total iron chromatograms of N8 sample

图3 N9乳酸菌苹乳发酵试样总离子流图Fig.3 Total iron chromatograms of N9 sample

图4 N13乳酸菌苹乳发酵试样总离子流图Fig.4 Total iron chromatograms of N13 sample

图5 CK总离子流图Fig.5 Total iron chromatograms of CK sample

MLF试样中共初步分离定性出70种挥发性成分(表1),其中C5酒样检出42种,N8酒样检出46种,N9酒样检出46种,N13酒样检出48种,对照酒样检出35种。由此可见MLF可丰富葡萄酒的挥发性物质的种类。这些化合物中,高级醇和酯是两类最主要的挥发性组分,其中酯类25种,醇类25种,酸类6种,萜烯类6种,其他物质8种。5种试样共有的组分18种,醇类、酯类各占一半,MLF试样共有的组分有25种,和对照试样相比新增醇类3种,酯类2种,其他2种,且MLF试样醇类、酯类相对含量发生变化。由此可见筛选出的乳酸菌进行MLF后对葡萄酒挥发性物质的种类及相对含量均有影响。

2.2 醇类成分比较

试样醇类物质比较分析可知,C5、N8、N9、N13及对照试样中总醇类的相对含量分别为39.35%、54.99%、67.20%、56.22%、30.82%,醇类个数分别为18、19、21、20、11。MLF试样中醇类物质种类及相对含量均高于对照(图6)。可见,MLF可以增加葡萄酒的醇类物质种类及促进醇类物质的释放。

图6 不同来源乳酸菌株MLF后与对照酒样醇类比较Fig.6 Comparison of alcohols indifferent MLF wine samples with control

5种试样中共有的醇类组分8种,其中1-戊醇和苯乙醇的相对含量都显著高于其他醇类。具有酒香、果香的1-戊醇在C5酒样中相对含量最低,仅为对照的85%,在N13酒样中相对含量最高,为对照的2倍。具有花香的苯乙醇在对照试样中相对含量最低,是9.38%,MLF试样中均有所增加,N8酒样增加最多,为对照的2.5倍。葡萄酒中的高级醇主要是由氨基酸或己糖通过丙酮酸途径生产的[13],乳酸菌菌株来源、菌属及菌株个体存在差异,菌株代谢过程及酶活不同,最终导致代谢产物及次级代谢产物不同。

MLF试样中共有醇类组分11种,较对照新增醇类物质包括叶醇、芳樟醇、苯甲醇。这些醇类的相对含量均较小,感官表现为青香、花香和果香,对葡萄酒香气品质有一定修饰作用。MLF试样中苯乙醇和正己醇的相对含量增加,这与张军翔2006年研究的结果MLF葡萄酒中苯乙醇的含量减少不符[23],可能是发酵菌株不同造成的。

2.3 酯类成分比较

样品中酯类物质比较显示,C5、N8、N9、N13及对照试样中总酯类物质相对含量分别为56.48%、37.20%、25.44%、35.24%、61.30%。MLF试样酯类物质相对含量均低于对照试样(图7)。MLF试样的酯类个数和对照接近,但种类存在较大差异。C5酒样酯类相对含量略低于对照,N9酒样相对含量最低,为对照的42%,N8酒样和N13酒样的酯类相对含量相差不大,约为对照的一半。

5种试样共有的酯类组分8种,分别为乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、水杨酸甲酯、乙酸苯乙酯、9-十六碳烯酸乙酯。MLF试样中均新增酯类有2种,分别是正己酸乙酯、棕榈酸乙酯,这些新增酯类感官表现为酯香、果香及奶油香,使葡萄酒香气更丰富。酯类物质是葡萄酒的重要香气成分,绝大多数的酯类能产生令人愉悦的香气,大部分酯类物质感官特性为水果香味[24]。由此推测,MLF试样中,C5酒样水果香较其他酒样好。这可能是由于C5乳酸菌是筛自泡菜的植物乳杆菌,其酯酶活性较其他筛自酸奶的乳酸菌菌株高,促进了酯类物质的形成。

表1 葡萄酒样的挥发性化合物组成

续表

注:
注:表中“-”表示未检出;“—”表示感官特性未见报道。

图7 不同乳酸菌株MLF后与对照酒样酯类比较Fig.7 Comparison of esters indifferent MLF wine samples with control

2.4 酸类成分比较

由图8可知,对照试样检测出6种挥发酸,相对含量占4.00%;C5酒样酸类物质种类及相对含量最少,占1.23%,仅为对照的31%;N9酒样4种酸,占2.91%;N8和N13酒样酸种类都为5种,相对含量分别为4.21%、3.46%。5种试样中共有酸类2种,分别是乙酸和辛酸。和对照试样相比,经过乳酸发酵的试样中乙酸含量都有所增加,C5酒样增加最少,占0.75%。其他MLF试样乙酸相对含量都较高,N8酒样最高,达1.59%,其次是N13、N9,乙酸分别占1.4%和1.44%。辛酸在对照试样中最高,达1.91%,4种MLF试样均下降到0.6%以下。挥发酸具有不愉快的气味,较高的挥发酸能掩盖葡萄酒的香气,对葡萄酒的感官品质造成负面影响[25],所以认为C5酒样较其他酒样香型更好。

图8 不同乳酸菌株MLF后与对照酒样酸类变化比较Fig.8 Comparison of acids indifferent MLF wine samples with control

2.5 主要挥发性组分的分析比较

5种试样中相对含量较高的共有挥发性成分比较(图9)显示,对照试样中的苯乙醇相对含量低于4种MLF试样,N8酒样相对含量最高,是对照的2.5倍,说明N8菌苹乳发酵可显著增加葡萄酒愉快的花香感;对照酒样的辛酸乙酯相对含量最高,为其他试样的2倍以上,可见MLF处理可降低辛酸乙酯的相对含量。N9和N13酒样辛酸乙酯下降幅度最大,约为对照的16%。C5降低较少,约为对照43%;具有青草或香蕉香感的戊醇,在C5酒样和N8酒样的相对含量较低与对照无明显差异,在N9酒样和N13酒样相对含量较高,为对照的2倍;C5酒样中具有果香、酯香正己酸乙酯较高,其它三种酒样的含量相差不大,对照酒样中不含己酸乙酯,说明它是MLF生成的;具有香蕉、果香感的乙酸异戊酯在C5酒样中含量最高,是对照的1.5倍,其他三种酒样相差不大,仅为对照的一半。C5酒样中各主要香气物质相对含量较均一,酒样酒香、果香、花香、脂肪和醛香较为协调;N8酒样中具有花香、玫瑰香的苯乙醇占23.84%,花香突出;N9、N13酒样中1-戊醇相对含量均最高,分别为29.96%、31.39%,青草香、香蕉香突出;对照酒样中辛酸乙酯达到31.22%,花果香、醛香突出。

图9 几种酒样主要挥发性成分比较Fig.9 Comparison of major volatile components from samples

3 结论

3.1 MLF试样中共初步分离定性出70种挥发性成分,其中C5酒样中检出42种,N8酒样检出46种,N9酒样检出46种,N13酒样检出48种,对照酒样检出35种。MLF试样中挥发性化合物种类均多于对照,释放量较对照大。说明MLF过程样品中有新的挥发性组分形成,同时促进挥发性物质的释放。

3.2 5种试样共有挥发性组分18种,MLF试样共有组分25种,MLF新产生7种挥发性物质,分别是叶醇、芳樟醇、苯甲醇、正己酸乙酯、棕榈酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、大马士酮。这些物质主要增加了产品的青香、花香、果香、奶油香等香气,对葡萄酒香气品质有修饰作用。

3.3 乳酸菌来源不同,MLF试样香气表现不同。C5酒样,酯类相对含量最高,酸类相对含量最低,样品酒香、果香、花果、脂肪和醛香相协调;N8酒样,醇类相对含量最高,花香突出;N9和N13酒样中青草香、香蕉香突出;对照酒样花果和醛香突出。相比于其他菌株C5乳酸菌MLF酒样果香型较好且不良风味物质少。

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Impact of several strains of lactic acid bacteria on the volatile components of dry red wine

ZHOU An-ling,MI Lan,LI Ji-xin,JIANG Yu-mei*

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

The dry red wine completed the alcohol fermentation was used as raw material. 4 of lactic acid bacteria were screened to conduct malic acid-lactic acid fermentation(MLF),malolactic un-fermentation as control sample. The volatile components of samples were detected by head space solid-phase micro-extraction with gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME/GC-MS). The results showed that,70 volatile components were detected from 4 MLF samples,42,46,46 and 48 kinds of volatile compounds were separately determined from C5,N8,N9 and N13 sample. 35 kinds of volatile compounds were come from control sample. The quantity of volatile components from MLF samples were more than control sample,indicating some new volatile components were produced during MLF,at the same time,the quality of the wine aroma had a modification. The esters of C5 sample was higher than other 3 samples,the relative content of 56.48%,the volatile acids was minimum of 1.23%,the volatile quality was better than other test samples. C5 lactobacillus was filtrated from pickled vegetable.

lactobacillus;volatile compound;malolactic fermentation;headspace solid phase micro extraction(HS-SPME);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

2014-09-22

周安玲(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏，E-mail：1042501372@qq.com。

*通讯作者:蒋玉梅(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：果蔬加工、葡萄酒、食品风味物质分析的研究，E-mail：jym316@126.com。

“陇原青年创新人才扶持计划”项目；财政厅甘肃省高等学校基本科研业务费项目(2010-1-235)；省科技厅科技支撑计划(1011NKCA059)；盛彤笙科技创新基金(GSAU-STS-1335)。

TS262.6

A

1002-0306(2015)15-0136-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.021