红曲霉与红花双向发酵体系的初步研究

谢炎福 杜苗苗 张优仪

摘要：以红曲霉（Monascus）作为发酵菌株，中药红花（Carthamus tinctorius）作为发酵基质进行了双向发酵试验。结果表明，红花对于红曲霉的生长和次级代谢产物莫那可林K （Monacolin K）的积累具有促进作用，同时基质中红花黄色素提取率也得到了提高，经过对发酵条件的优化，双向发酵的最佳工艺条件为红曲霉接种量6%，红花添加量3%，葡萄糖添加量6%，发酵温度28 ℃，发酵11 d。在此工艺条件下，Monacolin K的产量达到25.23 mg/L，比未加红花的对照提高了32.6%；红花黄色素提取率为5.18%，比未加红曲霉的对照提高了8.1%。

关键词：红曲霉（Monascus）；红花（Carthamus tinctorius）；双向发酵；红花黄色素；Monacolin K

中图分类号：TQ925+.7；Q93 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2718-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.042

Preliminary Study on Bi-fermentation of Monascus and Carthamus tinctorius

XIE Yan-fu，DU Miao-miao，ZHANG You-yi

（Department of Life Science， Luoyang Normal University， Luoyang 471022， Henan， China）

Abstract： The bi-fermentation experiment，Monascus as fermentation strain and traditional Chinese medicine Carthamus tinctorius as medium，was carried out. The result showed that，Carthamus promoted the growth of Monascus and the yield of Monacolin K，and simultaneously the extraction rate of yellow pigment in Carthamus tinctorius was increased. Through optimization of fermentation condition， the optimal technological parameters for production of yellow pigment in Carthamus tinctorius and Monacolin K in Monascus were obtained， that was Monascus inoculum 6%，Carthamus tinctorius 3%，glucose 6%， fermentation temperature 28 ℃，and aerobic fermentation time 11 d.Under this condition，the yield of Monacolin K was up to 25.23 mg/L， increased by 32.6% than the control without addition of Carthamus tinctorius， meanwhile yellow pigment was up to 5.18%， increased by 8.1% than the control without addition of Monascus.

Key words： Monascus； Carthamus tinctorius； bi-fermentation； yellow pigment in Carthamus tinctorius； Monacolin K

红曲霉（Monascus）的使用在中国具有悠久的历史，广泛应用于食品、医药等多个领域，红曲霉能产生红曲色素、莫那可林K（Monacolin K）、γ-氨基丁酸等多种生物活性成分，具有很高的保健及药用价值[1，2]。红花（Carthamus tinctorius）具有活血化淤、抗肿瘤、抗菌等功效[3，4]，其生物活性成分主要为红花黄色素[5]，红花黄色素的传统提取工艺为水浸法，提取率较低。红曲霉和红花在药性机理上具有较高的相似性[6]，红曲霉能产生淀粉酶、葡萄糖苷酶、纤维素酶等丰富的酶系[7]，能有效破除植物类中药细胞壁和果胶类物质形成的物理屏障，使有效活性成分溶出，从而提高提取效率，具有对中草药活性成分进行转化、修饰以及产生新的活性物质的巨大潜力。将红曲霉与红花一起共同构建双向发酵体系产生的药性菌质比两者分别入药更能得到优势互补的效果[8]。本研究在前期中药筛选的基础上，利用红花作为红曲霉发酵的药性基质，旨在探讨通过双向发酵提高红花活性成分红花黄色素提取率以及红曲霉中Monacolin K等有效活性成分含量的可行性，并进行发酵条件的初步优化，为红曲霉药性基质双向发酵的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 红曲霉为洛阳师范学院微生物实验室保存菌种。红花购自洛阳医药城，将红花于60 ℃培养箱中干燥至质量恒定，用实验室小型粉碎机粉碎过120目筛备用。

1.1.2 发酵培养基 参照文献[9]的培养基配方并进行适当的改动，改动后的培养基配方：葡萄糖10 g，红花粉20 g，硝酸钠3 g，酵母提取物1 g，磷酸氢二钾1 g，7水合硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，7水合硫酸亚铁0.01 g，pH 5.6，用自来水定容至1 L。

1.1.3 试剂 葡萄糖、硝酸钠、酵母膏、磷酸氢二钾、7水合硫酸镁、氯化钾、7水合硫酸亚铁、乙醇、石油醚等均为分析纯。红花黄色素纯品（纯度大于99%）；Monacolin K纯品（纯度大于99%）。以上药品均购自郑州三鑫化学试剂有限公司

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计：UV2000，岛津；水浴恒温振荡器：SHZ-A，上海博迅实业有限公司；恒温培养箱：DHP-9052，上海申贤恒温设备厂；小型固体样品粉碎机：FW-80，金坛市春兰实验仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵种子液的制备 将经活化的红曲霉斜面孢子用无菌水洗下，倒入含0.05%吐温-80生理盐水的三角瓶中，三角瓶中预先装有数十粒玻璃珠，在摇床上振荡，充分打散孢子，制成孢子浓度为1×106个/mL的孢子悬液，即为红曲霉种子液。

1.3.2 发酵工艺流程 将80 mL发酵培养基装入250 mL三角瓶中，于121 ℃高压灭菌15 min，冷却后按照6%的比例接入预先制好的红曲霉孢子悬液，在180 r/min、30 ℃摇床上培养3 d，然后降低温度至28 ℃继续培养2～12 d（采用变温发酵更有利于Monacolin K的产生[10]），隔天定时带瓶称质量，测量各项指标，发酵结束后，将发酵液过滤，烘干，称量红曲霉菌丝体生物量。

1.3.3 发酵条件优化单因素试验 单因素试验设计包括红曲霉接种量：0、3%、6%、9%、12%；葡萄糖添加量：0、3%、6%、9%、12%；红花添加量：0、1%、2%、3%、4%、5%；发酵时间：30 ℃发酵3 d后，28℃条件下继续培养2～12 d；温度：26、28、30、32 ℃。每个处理3次重复，分别测定红曲霉菌丝体生物量，以Monacolin K含量、红花黄色素提取率作为评价指标，培养方法同上，每次改变一个条件，测定不同条件下各指标的变化情况。

1.3.4 发酵条件优化正交试验 选用L9（34）正交设计，在单因素试验的基础上，选取红曲霉接种量、培养温度、红花添加量、葡萄糖添加量等4个培养条件进行优化，因素与水平见表1，并以红花黄色素提取率、Monacolin K含量为考察指标确定最优发酵条件，每个试验2个重复。

1.4 测定指标及分析方法

红曲霉菌丝体生物量测定：采用重量法，将发酵液连带菌丝球一起在3 000 r/min的摇床上离心15 min，收集沉淀，离心2次，将2次的沉淀物混合，在60 ℃烘箱中烘干至质量恒定，称量。

Monacolin K含量测定：参照文献[10]的方法，取6 mL发酵液，加入14 mL甲醇，摇床振荡（30 ℃、200 r/min）2.5～3.0 h后，8 000 r/min离心20 min，上清液用有机滤膜过滤后，在236 nm波长处测定其吸光度。

红花黄色素浓度测定：参照薛伟明等[11]的方法并略有改动。红花黄色素提取率的计算公式[12]：红花黄色素提取率=[（红花黄色素浓度×稀释倍数×提取液体积）/红花质量]×l00%。

1.5 数据处理

所有数据采用SPSS软件进行方差分析，多重比较采用最小显著差数法（Least significant difference，LSD）法。

2 结果与分析

2.1 发酵时间对发酵结果的影响

在红曲霉接种量6%，葡萄糖添加量1%，红花添加量2%，摇床转速180 r/min，30 ℃的条件下培养3 d，然后降低温度至28 ℃继续培养2～12 d，以考察发酵时间对发酵结果的影响，结果如图1所示。由图1可知，红花黄色素提取率在发酵初期变化很小，发酵3 d后开始明显上升，至发酵7 d时达到高峰，维持4 d后至发酵第11天开始下降，红曲霉菌丝体生物量的变化与红花黄色素提取率的变化基本一致，呈高度正相关。红曲霉在葡萄糖存在的情况下，优先利用培养基中的葡萄糖作为碳源和能量来源，初期红花黄色素主要来源于水的提取作用，葡萄糖将要耗尽时红曲霉大量合成淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和其他酶类，分解红花中的糖类、脂肪和纤维素类以供自身的生长，随着这些营养成分的分解利用，打破了细胞壁和蛋白质的阻碍，有利于红花黄色素从胞内溶出，后期红花黄色素提取率下降可能是由于被红曲霉转变为其他物质或者代谢作为营养成分利用的结果。

Monacolin K含量呈现先增加后减少的趋势，发酵初期几乎测不到Monacolin K，Monacolin K含量高峰出现时间延后于菌体的产量高峰，说明Monacolin K是红曲霉的次生代谢产物，只有在红曲霉菌丝体量增加至平稳期后Monacolin K才大量合成。Monacolin K含量在发酵13 d时达到最大值，而红花黄色素提取率在发酵7 d时达到最大值，在发酵第11天，两者都相对较大，故选择最佳双向发酵时间为11 d，即30 ℃培养3 d，然后降低温度至28 ℃继续培养8 d。

2.2 红花添加量对发酵结果的影响

在红曲霉接种量6%，葡萄糖添加量1%，摇床转速180 r/min，30 ℃培养3 d，然后降低温度至28 ℃继续培养8 d的发酵条件下，考察红花添加量对发酵结果的影响，结果见图2。由图2可知，随着红花添加量的增大，红曲霉菌丝体生物量、Monacolin K含量和红花黄色素提取率均经历了一个先增长后降低的过程，均在红花添加量3%时达到最大值。说明一定量的红花对于红曲霉的生长和其有效活性成分Monacolin K的产生具有一定的促进作用。这可能是因为红花含有红花甙、肉桂酸、月桂酸等多种有效成分，刺激了红曲霉的代谢活动，从而分泌大量的相关酶类分解红花中的变性蛋白质作为自身的营养物质，提高了红花黄色素的溶出率。

2.3 红曲霉接种量对发酵结果的影响

在葡萄糖添加量1%，红花添加量3%，摇床转速180 r/min，30 ℃培养3 d，然后降低温度至28 ℃继续培养8 d的发酵条件下，考察红曲霉接种量对发酵结果的影响，结果见图3。由图3可知，随着红曲霉接种量的增大，红曲霉菌丝体生物量增加，红花黄色素提取率和Monacolin K含量则呈现先升高后降低的趋势，红花黄色素提取率在红曲霉接种量6%时达到最大，Monacolin K含量则在红曲霉接种量9%时达到最大。说明红花黄色素提取率和Monacolin K含量并不一直随着红曲霉菌丝体生物量的提高而增大，接种量过大或过小均不利于Monacolin K的生成以及红花黄色素提取率的提高。红曲霉接种量增大，菌体代谢旺盛，分泌大量的胞外酶类，有利于发酵基质的利用和菌体的生长，但是接种量过大，会导致发酵液过于黏稠，影响溶氧含量，最终影响产物的合成。

2.4 葡萄糖添加量对发酵结果的影响

在红曲霉接种量6%，红花添加量3%，摇床转速180 r/min，30 ℃培养3 d，然后降低温度至28 ℃继续培养8 d的发酵条件下，考察葡萄糖添加量对发酵结果的影响，结果见图4。由图4可知，随着葡萄糖添加量的增加，Monacolin K含量、红曲霉菌丝体生物量、红花黄色素提取率均呈现先升高后降低的趋势，说明葡萄糖过高或过低均不利于红曲霉的生长以及相关酶类和次生代谢产物的积累。Monacolin K含量和红曲霉菌丝体生物量均在葡糖糖添加量为6%时达到最大值，而红花黄色素提取率在葡萄糖添加量为3%时达到最大值，虽然在葡萄糖添加量6%时有所下降，但并不是很明显，所以仍取6%作为发酵时的适宜添加量。

2.5 温度对发酵结果的影响

在红曲霉接种量6%，葡萄糖添加量6%，红花添加量3%，摇床转速180 r/min，30 ℃培养3 d，然后调节至设定温度（26～32 ℃）继续培养8 d的发酵条件下，考察温度对发酵结果的影响，结果见图5。由图5可知，红曲霉菌丝体生物量和红花黄色素提取率均随着温度的上升而逐渐提高，不加红曲霉的对照组红花黄色素提取率也呈现同样的增加趋势，但在同样的温度条件下，经过红曲霉发酵的试验组红花黄色素提取率高于未经红曲霉发酵的对照组。说明较高的温度有利于红花黄色素在水中的溶解，另一方面还说明较高的温度有利于红曲霉对红花进行发酵，这可能和红曲霉纤维素酶、蛋白酶、果胶酶的活性或红曲霉发酵液在不同温度下酶类的成分构成有关系，双向发酵过程呈现的红花黄色素提取率的提高是红花黄色素溶出率随温度提高和红曲霉的发酵共同作用的结果。Monacolin K含量和红花黄色素提取率的变化趋势相反，随着温度的上升，Monacolin K含量呈现一个逐渐下降的趋势，但仍高于相应的不加红花的对照组。说明低温有利于Monacolin K的生成。综合两者的温度曲线，在28 ℃时两者产量均较高，所以确定28 ℃作为双向发酵的控制温度。

2.6 发酵条件优化正交试验结果

相对于其他4个因素，发酵时间对发酵结果的影响比较一致，所以固定发酵11 d作为正交试验的基础条件。由表2可知，各因素对红花黄色素提取率影响的主次顺序为B、C、A、D，其优化组合为A2B3C2D1，即红曲霉接种量6%、温度30 ℃、红花添加量3%、葡萄糖添加量3%时红花黄色素提取率取得最大值；各因素对Monacolin K含量影响的主次顺序为B、C、D、A，优化组合为A2B1C3D2，即红曲霉接种量6%、温度26 ℃、红花添加量4%、葡萄糖添加量6%时Monacolin K含量最高。经方差分析得出，红曲霉接种量、温度、红花添加量及葡萄糖添加量4个因素对Monacolin K含量均有极显著影响（P<0.01）；接种量、温度和红花添加量对红花黄色素提取率有极显著影响，葡萄糖添加量对红花黄色素提取率影响不显著（P>0.05）。

由多重比较分析可知，Monacolin K含量在红花添加量为3%和4%时无显著差异，故双向发酵的红花添加量取3%，即C2；因葡萄糖添加量对红花黄色素提取率无显著影响，而Monacolin K含量在葡萄糖添加量为6%时最佳，故双向发酵的葡萄糖添加量取6%，即D2；Monacolin K含量和红花黄色素提取率的最佳条件在温度方面差别很大，相对来说在B2水平，两者均取得较高的产量。所以综合考虑双向发酵的最佳组合为A2B2C2D2，即红曲霉接种量6%，发酵温度28 ℃，红花添加量3%，葡萄糖添加量6%。由于最佳发酵条件A2B2C2D2未出现在正交表中，故需要进行补充验证试验，在此条件下，验证的结果为红花黄色素提取率5.18%，比未利用红曲霉发酵的对照组（4.79%）提高了8.1%，Monacolin K含量达到25.23 mg/L，比未加红花的对照组（19.02 mg/L）提高了32.6%。

3 小结

红花的适宜添加对于红曲霉的生长和次级代谢产物Monacolin K的积累具有促进作用，红曲霉以红花作为药性基质提高了红花黄色素的提取率，红曲霉和红花双向发酵能同时提高Monacolin K的产量和红花黄色素的提取率；经过发酵条件的优化，最佳工艺条件为：红曲霉接种量6%，红花添加量3%，葡萄糖添加量6%，发酵温度28 ℃，发酵11 d。在此最佳条件下，Monacolin K的产量达到25.23 mg/L，比未加红花的对照组提高了32.6%；红花黄色素提取率为5.18%，比未利用红曲霉发酵的对照组提高了8.1%。红曲霉和红花双向发酵相互影响，有可能对现有成分进行了生物转化或产生了新的活性成分，有待继续在这一方面进行深入研究。

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