多倍体川贝母脱毒苗的诱导

江明殊　王跃华　刘涛等

摘要：以有效组分含量高的多倍体川贝母鳞茎芽为研究对象，开展快速获得脱毒苗的培养研究。结果表明，对多倍体川贝母鳞茎芽诱导不定根选取在35 ℃高温预脱毒处理后，选取生长状况好的不定根，切取其长度为0.4 mm的生长点区域进行培养，不仅愈伤组织诱导率高（57.89%），而且经检测其脱毒效果也最好（脱毒率为92.87%）。最佳多倍体脱毒鳞茎芽诱导培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA，培养40 d后出芽率达到77.31%；最佳生根培养基为1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA，培养30 d后生根率为8917%。

关键词：川贝母；多倍体；脱毒苗；诱导；愈伤组织

中图分类号： Q945.39 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0041-02

川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）是百合科多年生草本植物，具有清热润肺、化痰止咳之功效，是稀有的治疗咳嗽等的良药[1]，由于川贝母价格昂贵，加上近年来无计划盲目地采挖，使其自然资源日趋枯竭[2-3]，这种状况预计在近几十年内也难以缓解。川贝母植物的繁殖常采用以种子进行的有性生殖和以鳞茎进行的无性繁殖2种方式。无论是哪种方式，对于多年生的川贝母植物都会因各种环境因素而使其染上病毒，而且经过长期繁殖，这些病毒会在细胞体内不断累积，从而严重抑制其生长，此外其性状、产量等也会受到影响，最终造成川贝母药材的品质和产量大大地下降。

无论是适应性还是生活力，多倍体植物与二倍体植物相比都有许多优势。例如，多倍体植物因基因数目增多、基因活性及酶的差异性增强，其生态适应性和对逆境的抗耐性较高[4]；随着药用植物基因倍性的增加，通常还能导致次生代谢产物含量的变化，从而得到有效含量较高的产物。已有报道表明，药用植物多倍体可大幅度提高药材的产量[5-7]，而且笔者所在课题组也在前期研究中发现多倍体川贝母的有效含量比自然野生二倍体川贝母高得多。将川贝母植物的脱毒苗培育技术和多倍体诱导技术进行有机结合，能培育出品质优良、生长速度快、有效组分含量高和抗逆性强的多倍体川贝母脱毒苗，有利于川贝母大规模生产。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验材料来自成都大学组培实验室培育的多倍体川贝母鳞茎。

1.2 试验方法

1.2.1 多倍体不定根的获得 将多倍体川贝母组培鳞茎先接种于1/2MS+0.2 mg/L IBA的培养基中，在培养温度为 21 ℃、光照时间6 h/d且光照度为1 000 lx的条件下继续培养，获得形状粗大的不定根。

1.2.2 多倍体脱毒愈伤组织的诱导培养 将多倍体不定根从根基部切下后接入MS+0.3 mg/L 6-BA+150 mL/L甘油的培养基中，设置不同温度条件（35、36、37、38、39、40 ℃，分别记为A1、A2、A3、A4、A5、A6处理）且在无光照条件下进行20 d预培养处理，观察不定根的生长状况，20 d后统计经上述不同方法处理的不定根成活率。选取最佳温度处理的不定根，在超净工作台上切取根尖生长点处0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mm 区域的细胞（分别记为B1、B2、B3、B4、B5处理），将其接入pH值为5.8的愈伤组织诱导培养基中，在温度18 ℃、光照时间6 h/d、光照度800 lx的条件下培养 30 d，获得多倍体愈伤组织，观察统计愈伤组织诱导率和生长情况。

1.2.3 病毒检测 采用双抗体夹心ELISA方法[8]（DAS-ELISA）对培育的川贝母多倍体愈伤组织进行病毒检测。

1.2.4 鳞茎芽的诱导 选取质地较紧密、生长速度快且颜色为黄白色或淡黄色的多倍体愈伤组织，将其接入添加0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L 6-BA，0、0.2 mg/L IAA不同浓度激素的多倍体鳞茎芽诱导MS培养基（分别记为C0、C1、C2、C3、C4处理）中，同时以不添加任何激素的MS培养基为对照，在培养温度为20 ℃、光照时间16 h/d、光照度为2 000 lx的条件下培养20 d，获得川贝母多倍体鳞茎芽。

1.2.5 多倍体鳞茎芽的生根培养 在超净台上切取生长20 cm的多倍体鳞茎芽作为无根苗，将其转入添加不同浓度NAA （0、0.2 mg/L）、IBA （0、0.1、0.2、0.3 mg/L）激素的1/2MS 生根培养基（分别记为D1、D2、D3、D4处理）中诱导生根，30 d后观察记录鳞茎芽的生根情况。

1.2.6 炼苗和移栽 选取长出2条以上不定根的川贝母多倍体脱毒苗，打开瓶盖，在室内炼苗3～5 d后从培养瓶中取出，洗去不定根上的培养基，移栽至消毒后的松软土壤中生长。

2 结果与分析

2.1 不同处理温度对不定根生长的影响

本研究采用高温作为多倍体川贝母脱毒的前期处理方法，从表1可以看出，随着温度的增加，外植体的成活率呈现逐渐降低的趋势。当温度为35 ℃时，成活率最高，为6309%；而温度升到40 ℃时，成活率最低，只有27.12%。符国芳曾报道，对外植体的热处理脱毒通常在35～54 ℃较适宜[9]，本研究选取了35～40 ℃作为试验条件，虽然有报道称温度越高对脱毒的效果越好，但从试验结果可以看出，高温对外植体存活率的影响也是较大的。综合整体因素考虑认为，35 ℃时为不定根前期脱毒的最佳温度。

2.2 不同根尖长度对脱毒效果的影响

外植体的大小同样会影响脱毒的效率[10]，通常情况下采用茎尖脱毒所选取的茎尖大小一般为0.1～0.5 mm，高于这个范围值脱毒效果不好，太低又不利于愈伤组织的形成。从表2可以看出，选取不同根尖长度对脱毒的影响有着类似的结果，随着根尖长度的不断增加，脱毒率基本逐渐降低，但是愈伤组织诱导率却与之成反比。例如，0.2 mm根尖长度的脱毒率最好，达到了95.16%，但是其愈伤组织诱导率只有2216%；1.0 mm根尖长度的脱毒率仅有63.13%，而愈伤组织诱导率却是所取根尖长度中最高的，达到了93.64%。综合整体因素考虑可知，选取根尖长度为0.4 mm时为最佳，其脱毒率在5个处理中较高，为92.87%，并且其愈伤组织也较易形成，诱导率达到了57.89%。