脂肪间充质干细胞分泌的Exosome促进结肠癌细胞系上皮间质转化△

孙昭 薛春玲 高鹤丽 白春梅 赵林 韩钦#

1中国医学科学院北京协和医院肿瘤内科，北京100730

2中国医学科学院基础医学研究所组织工程中心，北京100005

脂肪间充质干细胞分泌的Exosome促进结肠癌细胞系上皮间质转化△

孙昭1薛春玲2高鹤丽1白春梅1赵林1韩钦2#

1中国医学科学院北京协和医院肿瘤内科，北京100730

2中国医学科学院基础医学研究所组织工程中心，北京100005

目的研究间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）来源的Exosome对结肠癌细胞系HCT8上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的影响。方法从人脂肪组织中分离出MSC后，对MSC进行培养并传代，并对MSC的分化能力进行鉴定。在人脂肪来源的MSC中提取Exosome后，用透射电子显微镜观察并拍照，并用蛋白质印迹法检测其抗原表达情况。在HCT8培养体系中加入人脂肪来源的MSC分泌的Exosome，定量PCR和蛋白质印迹法检测上皮和间质转化相关标志物的表达，细胞侵袭和迁移实验检测人脂肪来源的MSC分泌的Exosome对HCT8迁移和侵袭的影响。结果人脂肪来源的MSC具有多系分化能力，人脂肪来源的Exosome直径为40～100 nm，表达CD63、HSP70和HSP90，下调HCT8上皮相关标志E-cadherin和ZO-1的表达，上调间质相关标志Fibronectin的表达，促进HCT8的迁移和侵袭。结论人脂肪来源的MSC分泌的Exosome可促进结肠癌细胞系HCT8的EMT。

间充质干细胞；Exosome；结肠癌；上皮间质转化

Oncol Prog,2015,13(3)

肿瘤的生物学行为并不完全由肿瘤细胞本身所决定，肿瘤微环境中的非肿瘤细胞在肿瘤的发生、发展过程中所发挥的作用越来越受到研究者的重视。MSC虽然只占肿瘤组织中细胞总数的0.01%～1%[1]，但是其对肿瘤的发展有着重要的作用。研究发现，肿瘤微环境中的MSC具有促进上皮来源的肿瘤细胞EMT的作用[2-3]，从而促进肿瘤转移。但是，MSC调控肿瘤细胞EMT的机制仍需被进一步阐明。Exosome是活细胞内多囊内吞体分泌的、并通过膜融合来分泌到细胞外的、直径多为30～100 nm的小囊泡体，可在细胞间传递多种分子。本研究探讨MSC分泌的Exosome对结肠癌EMT的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

成人脂肪组织取自在北京协和医院整形外科接受吸脂手术的25～35岁的健康女性，研究经中国医学科学院基础医学研究所伦理委员会批准，供者均签署知情同意书。从脂肪组织中分离MSC的方法简述如下：将吸脂术采集的脂肪组织用D-Hanks缓冲液洗去血细胞和麻醉药，再用0.2%Ⅱ型胶原酶消化1 h，之后用D-Hanks缓冲液洗涤2遍以除去胶原酶，离心收集细胞。细胞以2×106/m l的密度接种于含95%的DMEM/F-12（购自Gibco公司）、5%的胎牛血清（fetal calf serum，FBS；购自Hyclone公司）、20 ng/m l表皮细胞生长因子（epidermal grow th factor，EGF）、100 U/m l链霉素和100 U/m l青霉素的培养基中，并在37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中培养。1天后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3天进行半量换液。当细胞融合达70%～80%时，用0.125%胰蛋白酶、0.01%EDTA进行常规消化，并将细胞按照1∶3的比例进行传代。

1.2 MSC分化能力的鉴定

取第6代人脂肪来源的MSC以2×104/m l的密度接种于T25培养瓶中，贴壁过夜并观察，细胞融合达70%～80%后，分两组，分别将培养基更换为成骨诱导培养液（H-DMEM培养基中加入10%的FBS、100 nmol/L地塞米松、0.2 mmol/L维生素C和10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠）和成脂诱导培养液（高糖DMEM培养基中加入10%的FBS、1×10-6mol/L地塞米松、50μg/m l维生素C和100μg/m l的IBMX），继续培养，每隔两天进行一次半量换液，MSC分化能力的鉴定方法为茜素红染色（成骨）和油红O染色（成脂）。茜素红染色鉴定成骨分化的原理为：沉积的钙与茜素红发生显色反应，在细胞外基质中被染成橘红色，细胞本身则被染成粉红色；MSC成骨诱导分化12天的细胞用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10m in，双蒸水冲洗3次，0.1%茜素红-Tris-HCL 37℃，30m in，蒸馏水冲洗，干燥，封片；倒置显微镜下观察。阳性结果判定为：在细胞外基质中可见被染成橘红色的矿化结节。油红O染色鉴定成脂分化的原理为：油红O易溶于脂质；MSC成脂诱导分化12天的细胞用PBS冲洗2次后，用中性甲醛固定10m in，蒸馏水冲洗，每孔加500μl油红O工作液，染色5m in，甘油封片；倒置显微镜下观察。阳性结果判定为：细胞质中的脂滴被染成圆形饱满的亮红色。

1.3 Exosome的提取与鉴定

将第6～8代培养的人脂肪来源的MSC继续培养48小时后更换为无血清的DMEM/F12培养基，继续培养24小时后，收取上清，离心去细胞碎片，然后用100 000MW分子量的滤膜过滤后进行浓缩（200m l浓缩至1～2m l），浓缩后的Exosome用透射电子显微镜观察并拍照，并用蛋白质印迹法检测其抗原表达。

提取Exosome总蛋白，经BCA法定量，取40mg总蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转到PVDF膜上。一抗CD63（购自Lifetechnology公司），以及HSP70和HSP90（均购自Santa Cruz公司）1∶1000在4℃下过夜，内参为GAPDH（购自Santa Cruz公司），二抗室温孵育1 h，ECL法荧光显色，并拍照。

1.4 上皮和间质相关标志蛋白表达的检测

结肠癌细胞系HCT-8购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，在含10%FBS的HDMEM培养基中培养，每2～3天进行常规消化传代。将其以1×105/m l的密度接种于6孔板，加入1000 g/m l的MSC来源的Exosome，每3天进行常规消化传代，在第10天时常规提取HCT8的总RNA和总蛋白。

实验分为对照组和Exosome处理组，Exosome处理组在HCT8的培养基中加入人脂肪来源的MSC分泌的Exosome，两组于第10天分别用定量PCR法和蛋白质印迹法检测其上皮和间质相关的标志蛋白在mRNA水平和蛋白水平的表达。

蛋白质提取和蛋白质印迹法检测的方法具体如下：提取细胞总蛋白，经BCA法定量，两组取40mg总蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转到PVDF膜上。一抗E-cadherin（购自R&D公司），ZO-1、Fibronectin、Vimentin、Sip1（均购自Santa Cruz公司），1∶1000在4℃下过夜，内参为GAPDH，二抗室温孵育1 h，ECL法荧光显色，并拍照。

用Trizol法抽提总RNA，并逆转录为cDNA，基因表达水平用定量PCR检测（SYBR法），定量PCR数据的计算方法是每份模板做3个平行样。

采用GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法来计算各组样品mRNA表达的相对值，公式为：ΔCt=Ct目的基因－Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组，相对表达量= 2－ΔΔCt。引物序列见表1。

1.5 MSC来源的Exosome对HCT8细胞迁移和侵袭影响的检测

为进一步分析人脂肪来源的MSC分泌的Exosome对HCT8 EMT的影响，本研究检测了对照组（HCT8未处理组）和Exosome处理组HCT8细胞系的迁移和侵袭能力。细胞侵袭和迁移实验在Transwell（Costa）小室中进行，

细胞迁移实验方法为：Transwell下室内加入500μl含10%FBS的DMEM-高糖培养基，将Transwell小室放入下室内；将HCT8未处理组和Exosome处理组各200m l的细胞悬液（1×106/m l）分别加入Transwell上室内，置于37℃细胞培养箱内培养24 h后用4%多聚甲醛固定，结晶紫法染色，用显微镜观察迁移细胞数。分别取4个40倍镜下的视野，拍照、计数后，计算每个视野下的平均细胞数。

侵袭实验方法是在Transwell小室内预先铺ECM胶，培养72 h后固定。其他部分同迁移实验。

1.6 统计学方法

定量PCR和Transwell的数据以均数±标准差表示，采用t检验和单因素方差分析进行检验。双侧检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。每组实验至少重复3次以校正P值和控制系统误差。

2 结果

2.1 人脂肪来源的MSC具有多系分化能力

从成人脂肪中提取的MSC具有典型的成纤维样细胞的形态；在成骨或者成脂诱导的第12天时，分别予以茜素红染色（图1A）或油红O染色（图1B），均为阳性，证明其具有成脂和成骨的分化能力。

2.2 Exosom e的鉴定

从人脂肪来源的MSC培养上清中提取Exosome，用蛋白质印迹法法检测其抗原表达的结果为CD63、HSP70、HSP90均阳性（图1C），和Lin等[4]的研究结果相似。透射电子显微镜下，观察到Exosome为40～100 nm的小囊泡结构（图1D）。

2.3 上皮和间质相关标志蛋白表达的检测结果

表1 定量PCR引物序列

在HCT8的培养基中加入MSC来源的Exosome后，与对照组（HCT8未处理组）相比，上皮和间质相关的标准基因在mRNA水平表达，E-cadherin显著降低（P=0.001），ZO-1显著降低（P= 0.002），Fibronectin显著升高（P=0.0001），其他基

因在mRNA水平表达变化不明显（图2A）。上皮和间质相关的标志蛋白在蛋白水平的表达结果为：与对照组（HCT8未处理组）相比，Exosome处理组上皮相关蛋白E-cadherin和ZO-1的表达水平明显降低，而beta-catenin的表达水平变化不大；间质相关蛋白Fibronectin的表达水平明显增高，Vimentin的表达水平变化不大（图2B）。

2.4 MSC来源的Exosome对HCT8细胞迁移和侵袭影响的检测结果

细胞侵袭和迁移实验发现，Exosome处理组的HCT8细胞系迁移和侵袭能力显著增加；迁移实验中Exosome处理组迁移过去的细胞数为（42.5± 9.1）个，对照组为（18.5±3.1）个（P=0.002）；侵袭实验中Exosome处理组侵袭过去的细胞数为（29.0± 3.5）个，对照组为（13.1±3.7）个（P=0.001），具体见图3。

3 讨论

循环中的MSC或者邻近正常脂肪组织中的MSC可归巢于肿瘤组织，从而促进肿瘤的形成和发展。在肿瘤患者组织切片中，MSC所在区域肿瘤细胞的E-cadherin表达下调，Vimentin表达升高[3]；而MSC和肿瘤上皮细胞共培养后，可以发现肿瘤上皮细胞Vimentin、Snail和Slug表达增加[2]，那么MSC对肿瘤细胞的EMT的作用如何实现值得探讨。细胞间信息交换的经典途径有两条：①细胞分泌的蛋白或者激素，通过细胞间隙对邻近的其他细胞起作用；②细胞质膜的外表面存在的蛋白质或糖蛋白、蛋白聚糖分子作为细胞的触角，可以与相邻细胞的膜表面分子进行特异性地相互识别和相互作用。但是有研究发现，MSC和肿瘤细胞之间的信息交换可以通过Exosome直接交换细胞质[5]。Exosome是多种活细胞内多泡体分泌的直径多在30～100 nm的小囊泡体，小囊泡里面包裹的主要是细胞质，可在细胞间传递多种分子。而MSC对肿瘤细胞EMT的作用也可能以Exosome作为信号传递的载体。

Exosome里面的成分比较复杂，富含蛋白和非编码RNA等，而Exosome和其来源的细胞质的成分也有很大的不同[6]。MSC分泌的Exosome对肿瘤细胞作用的报道较少。MSC分泌的Exosome不但可通过激活Wnt信号通路促进乳腺癌细胞系的EMT[4]，还可抑制乳腺癌细胞系表达血管内皮生长因子[6]。有研究发现，骨髓瘤患者骨髓MSC分泌的Exosome和正常骨髓MSC分泌的Exosome的功能是不同的，前者可以促进骨髓瘤细胞增殖，而后者无此作用[7]。所以，MSC分泌的Exosome对肿瘤的作用及其机制尚不清楚。

MSC分泌的Exosome对于结肠癌的影响尚未见报道。本研究首先鉴定了人脂肪来源的MSC分泌的Exosome，其具有和既往的研究报道相似的大小和特征[4]，然后，研究了人脂肪来源的MSC分泌的Exosome对结肠癌细胞系HCT8 EMT的影响，人脂肪来源的MSC分泌的Exosome可以下调HCT8上皮相关标志物的表达，上调间质相关标志物的表达，并且可以促进HCT8的迁移和侵袭，所以MSC对HCT8细胞EMT的影响可能是通过分泌Exosome来实现的。但是，本研究并没有揭示人脂肪来源的MSC分泌的Exosome调控结肠癌细胞EMT的机制。Exosome作为细胞的外泌体，里面包含大量的蛋白和非编码RNA；所以，下一步研究将聚焦在人脂肪来源的MSC分泌的Exosome调控结肠癌细胞上皮间质转移的信号通路上，这可能为结肠癌的治疗提供新的靶点。

［1］Ren G,Zhao X,Wang Y,et al.CCR2-dependent recruitment of macrophages by tumorp-educated mesenchymal stromal cells promotes tumor development and is m imicked by TNFα[J].Cell Stem Cell,2012,11(6):812-824.

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Exosomes from human adipose-derivedmesenchymalstem cells promoteepithelial mesenchymal transition in colon cancer△

SUN Zhao1XUEChun-ling2GAOHe-li1BAIChun-mei1ZHAO Lin1HANQin2#

1Departmentof InternalMedicine,Chinese Academy ofMedical Sciencesand Peking Union MedicalCollege Hospital,Beijing 100730,China
2Instituteof Basic Medical SciencesChinese Academy ofMedical Sciences,Schoolof Basic Medicine Peking Union MedicalCollege,Beijing 100005,China

ObjectiveTo study the influence of exosome derived from mesenchymal stem cell(MSC)on the epithelialmesenchymal transition(EMT)of colon cancer cell line HCT8.MethodMSC were separated from human adipose tissue and cultured,of which the differentiation potential was identified.The MSC-derived exosomes were observed using TEM,and the antibody expression was detected by western blot.HCT8 cells were co-cultured w ith MSC-derived exosome.The expression of epithelial and mesenchymal markers was detected by real time PCR and Western blot.Transwell chamberswere used in the in vitro migration and invasion assay.ResultHuman adipose derived MSC secreted 40-100 nm particles,which have the typical characteristics of exosomes as expressing CD63, HSP70 and HSP90.With the treatment of MSC-derived exosome,the expression of epithelial related markers E-cadherin and ZO-1 was down-regulated while the expression of mesenchymalmarker Fibronectin was up-regulated,and themigration and invasion capacity of HCT8 cellswere enhanced.ConclusionMSC-derived exosomes promotesmigration of the colon cancer cell line HCT8.

mesenchymal stem cell;exosome;colon cancer;epithelialmesenchymal transition

R735.3

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.03.16

国家自然科学基金（81101588；81472785）

#通信作者（corresponding author），e-mail:hanqinhanqin@126.com

2015-01-26)