4种富油微藻产业化应用前景比较研究

石　蕾，耿金峰，马欣欣，马卫敬，杨巧利，吴　洪（新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室，河北廊坊065001）

4种富油微藻产业化应用前景比较研究

石蕾，耿金峰，马欣欣，马卫敬，杨巧利，吴洪*
（新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室，河北廊坊065001）

摘要：为了筛选具有产业化应用前景的富油微藻，以实验室保藏的4株淡水和海洋微藻为研究对象，在室外自然条件下利用光径为3 cm和5 cm板式光生物反应器通气分批培养，通过测定微藻培养物的生物量和总脂含量等指标，从中筛选生长速度快、生物量和总脂含量高的微藻。结果表明：4株微藻的生物量产率和总脂含量分别在0.099 g/（L·d）～0.201g/（L·d）和20.4%dw～40.1%dw（%Dryweight）之间，分别是眼点拟微绿球藻（Nannochloropsisoculata）[0.201 g/（L·d），40.1%dw]、荒漠栅列藻（Scenedesmusdeserticola）[0.099g/（L·d），30.8%dw]、双形栅藻（Scenedesmusdimorphus）[0.142g/（L·d），20.4%dw]、若夫小球藻（Chlorallazofingensis）[0.155 g/（L·d），29.3%dw]，其中最具产业化潜力的微藻为眼点拟微绿球藻（Nannochloropsisoculata），其总脂产量和单位体积总脂产率分别为1.409 g/L和108.353 mg/（L·d），其中二十碳五烯酸（EPA）含量占干重含量的7.2%，是较优的EPA生产原料。

关键词：微藻；生物量；总脂含量；总脂产量；单位体积总脂产率；EPA

微藻是一类资源丰富、种类繁多、生长速度快、具有极大应用价值的生物资源。微藻及其代谢产物可用于天然食品加工、生物饵料、生物制药、生物肥料、污水处理、可持续生物能源生产等方面，具有重要的经济价值和社会价值[1]。

目前，国内外用于生物能源工业生产的原料油脂主要来自植物油和动物油，都存在着产量低、成本高、经济性差等缺点，而且不能持续提供[2]。微藻可以通过光合自养将太阳能转化为稳定的化学能，许多微藻在一定条件下能够在细胞中大量积累三酰甘油（TGA），有些藻种的总脂含量可占细胞干重的50%以上[3-4]，且油脂产量要远远高于其它高等产油植物，且有些微藻油中不饱和脂肪酸含量也非常高。因此，综合产量和品质考虑，微藻油是非常优质的生物油脂原料[5]。此外小球藻、螺旋藻等单细胞微藻类含有丰富的蛋白质、维生素、生物多糖、叶绿素、类胡萝卜素及人体所需的各种矿物质等[6]，有优异的营养保健功能，也可用于美容和生产化妆品，多用途开发潜力非常大。

从自然界中筛选到生长速度快、产量和含油量高、抗逆性强的优质藻种，是实现富油微藻产业化的前提。本研究利用新奥（ENN）微藻室外培养平台，对已经过ENN室内评价的4株优质野生型淡水和海洋微藻进行了室外生长和产油性能评价，为进一步实现微藻生物质的开发利用提供理论和技术参考。

1　材料与方法

1.1藻种

试验藻由ENN生物质能源技术中心藻种质库提供，各藻种的具体信息见表1。

表1　藻种类型和生长环境Table 1　Microalgae species and their habitats

1.2培养基配制

藻细胞培养采用的是人工海水培养基和BG11配方，配方参见文献[7-8]。采用经漂白粉消毒后的自来水，全部使用分析纯药品。生长实验使用的为全氮正常培养基，油脂诱导实验使用的为1/3氮培养基。

1.3培养条件

室外培养在河北廊坊新奥科技园生态城阳光大棚中进行，生长实验采用规格为100 mm×100 mm× 50 mm的玻璃板式反应器，油脂诱导实验采用规格为100 mm×100 mm×30 mm的玻璃板式反应器；培养过程中光照、温度等不予调控，每日跟踪测定。

1.4试验设计

将室内培养的藻种接入Φ6 cm柱状玻璃光反应器中，室外通气培养5 d～6 d后，再离心浓缩，接种到相应规格的玻璃板式反应器中：生长实验接种至50 mm光程反应器中，使用全氮培养基；油脂诱导实验接种至30 mm光程反应器中，使用1/3氮培养基。每株藻设置两个平行。实验周期为15 d。生长实验每天测定干重。油脂诱导实验每天测定干重，实验后期每隔两天测定总脂肪含量。

1.5测定方法

1.5.1生物量（干重Dry weight，dw）的测定

waltman纤维滤膜（0.45 μm）105℃烘干至恒重，干燥器中冷却后称重W0，取一定体积藻液V抽滤，再置于105℃烘箱中烘至恒重，干燥器中冷却后称重W1，干重/（g/L）=（W1-W0）/V。

1.5.2总脂含量测定

冻干藻粉a1（g）放置在具Telfnon螺口瓶盖小玻璃瓶中，加入10%DMSO-Methanol溶液，40℃砂浴磁力搅拌5 min；然后在4℃下磁力搅拌抽提，离心，上清液转移到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1∶1的diethyl ether-hexane 4℃下磁力搅拌抽提1 h，离心后转移上清液到上述抽提液瓶中。重复上述过程直到藻渣变白。在抽提液中加入纯水，振荡分相，移取有机相转移到另一小玻璃瓶中，用氮气吹干至恒重后，称重为a2（g）。

总脂含量Lipid content/（%dw）=a2/a1×100

1.5.3单位体积生物量产率、单位体积总脂产率

生物量产率 Biomass volumetric productivity/[g/ （L·d）]=（mt-m0）/（t-t0）

单位体积总脂产率Lipid volumetric productivity （mg/L·d）=mt×Lt/（t-t0）

总脂产量Lipid yield（g/L）=mt×Lt

式中：mt为收获时藻的干重，（g/L）；m0为接种时藻的干重，（g/L）；Lt为收获时总脂含量，（%dw）；t为试验结束时间，d；t0为试验起始时间，d。

1.5.4脂肪酸含量分析

由谱尼测试科技股份有限公司分析检测，采用GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》方法。

2　结果与讨论

2.1室外养殖条件下4种藻的生长曲线及生物量产率比较

室外养殖条件下4种藻的生长曲线及生物量产率比较见图1。

图1　4株微藻干重随时间的变化图Fig.1　Dry weight of four microalgae changes with time

在室外自然光条件下，不同藻种的细胞生长情况各不相同，由图1可见，4种藻初始干重在0.354 g/L～0.421 g/L之间，室外养殖14 d后，终浓度差别较大，N. oculata最高为3.211 g/L，S.deserticola最低为1.743 g/L，前者为后者的1.84倍。具体分析结果见图2。

图2　4株微藻生物量产率比较Fig.2　Comparison of biomass volumetric produtivity of four microalgae

N.oculata产率为0.201 g/（L·d），其后依次为C. zofingensis 0.155 g/（L·d），S.dimorphus为0.142 g/（L·d），S.deserticola最低为0.099 g/（L·d），N.oculata的产率明显高于其他藻。各种细胞在室外条件下的生长速率差别较大，N.oculata生长一直处于对数生长时期，14 d的比生长速率为0.204；S.deserticola生长从第2天经历了6 d的对数生长时期，比生长速率为0.143。S. dimorphus生长从第2天经历了9 d的对数生长时期，比生长速率为0.197；C.zofingensis从第2天开始经历了9 d的对数生长期，比生长速率为0.216。由此可知N.oculata是4株藻生长速度最快的藻株。

2.2室外养殖条件下4种藻的产油潜力比较

室外养殖条件下4种藻的产油潜力比较见图3。

图3　4种藻总脂含量变化趋势图Fig.3　The contents of total lipid of four typical microalgae changes with time

由图3可知N.oculata和C.zofingensis总脂含量都是逐渐升高的趋势，而S.deserticola和S.dimorphus的总脂含量在第10天达到最高。并且不同种类微藻总脂含量差异较大，养殖13天后，N.oculata的总脂含量达到40.1%dw，而其他3个藻的总脂含量在20.4%dw～30.8%dw之间。

总脂产量是总脂含量和生物量乘积，表征的是养殖过程中最终实际获得的油脂总量（g/L）。4种藻的总脂终含量、总脂单位体积产率和总脂产量见表2。

表2　4种藻的总脂终含量、总脂单位体积产率和总脂产量Table 2　Total lipid content，lipid volumetric productivity，lipid yield of four microalgae

由表2可知，N.oculata的总脂含量、总脂产率和总脂产量都明显高于其他3个藻，具有较高的产业化潜力。2.3眼点拟微绿球藻（N.oculata）藻粉品质分析

眼点拟微绿球藻（N.oculata）藻粉品质分析见表3、表4。

表3　N.oculata各成分组成Table 3　The composition of N.oculatas

表4　N.oculata脂肪酸成分Table 4　The fatty acid composition of N.oculata

由表3可知N.oculata细胞内蛋白质含量达到细胞干重的23.5%，并且油脂含量极其丰富，高达细胞干重的40%以上。由表4可知N.oculata脂肪酸成分中以棕榈酸（C16∶0）、棕榈油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1）、花生四烯酸（C20∶4）和EPA（C20∶5）为主，分别占干重含量的13.7%、8.8%、2.8%、3.1%和7.2%，是难得的单细胞蛋白生产、脂肪酸保健食品和水产育苗的代用饵料。

3　结论

富油微藻可作为保健品和食品添加剂，也是生物柴油生产的理想原料，它逐渐成为各国政府和藻类学家关注的焦点，例如眼点拟微绿球藻（N.oculata）具有生长速度快、含油量高等优点，且其脂肪酸含有大量EPA，在获取微藻油脂的同时提取EPA，是一种综合开发、降低微藻规模化生产成本的有效途经[7]。小球藻是单细胞藻类，常见的有普通小球藻（Chlorella vulgaris）、蛋白核小球藻（C.pyrenoidosa）、若夫小球藻（C.zofingiensis）等，若夫小球藻（C.zofingiensis）被认为是优良的虾青素和油脂生产株[8-9]。目前大规模生产微藻仍是一个世界难题，有大量工作需要开展。

目前对于微藻的研究集中于生长条件、营养方式等对其生长和油脂积累的研究，且实验室内研究较多。杨勋等研究得出若夫小球藻（C.zofingiensis）在自养方式下总脂含量为34.6%，总脂产量为0.69g/L[10]。李麒龙等研究为二形栅藻（S.dimorphus）室内养殖20 d后生物质产率和总脂产量均最高，分别达到了0.045g/（L·d）、和0.305 g/L[11]。李涛等研究结果是眼点拟微绿球藻（N.oculata）的生物量产量最高，16 d为0.47g/（L·d），总脂产量为2.8 g/L；若夫小球藻（C.zofingiensis）小于0.25 g/（L·d），总脂产量为1.3 g/L[12]，但实验条件为24 h连续光照，所以各项数值较高。

本文中以保藏在ENN藻种室的并通过室内油脂评价后优选出的产量和含油率较优的4株野生型的淡水和海洋微藻为研究对象，在室外自然条件下进行了生物质产率、油脂含量和油脂产量等因素的评价。结果显示眼点拟微绿球藻（N.oculata）的各项特性较优，远高于其他藻株。在室外光强下的生物质产率达到0.201 g/（L·d），同时其藻细胞中总脂含量和总脂产量分别达到了40.1%和1.409 g/L，尤其EPA含量占干重含量7.2%，EPA属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，是人体自身不能合成但又不可缺少的重要营养素。因此眼点拟微绿球藻（N.oculata）不论是生物量产率、总脂含量还是脂肪酸成分，均为较优的生物油脂原料，日后通过养殖工艺如反应器、培养基、曝气方式、采收方式等优化，获得更高的生产效率，服务于富油微藻的规模化培养及产业化应用。

参考文献：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.002

收稿日期：2015-06-10

基金项目：国家“973”计划重点项目（微藻高效固碳产能应用基础研究2012CB723606）

作者简介：石蕾（1981—），女（汉），助理研究员，硕士，从事微藻养殖与光反应器制造等方面研究。

*通信作者：吴洪（1963—），女（汉），国家“千人计划”，博士，主要从事微藻藻种选育和高效养殖方式研究。

A Com Parison Study on the Commercial Prospects for Four Types of Lipid-rich Microaegse

SHI Lei，GENG Jin-feng，MA Xin-xin，MA Wei-jing，YANG Qiao-li，WU Hong*
（State Key Laboratory of Coal-based Low Carbon Energy，ENN Science&Development Co.，Ltd.，Langfang 065001，Hebei，China）

Abstract：Four strains of freshwater and marine microalgae collected in laboratory were screened for their potential of oil production for industrial application.All microalgae were cultured in batch，with flat plate photobioreactors（light path，3 cm and 5 cm）.These microalgae were evaluated by measuring biomuss，total lipid content，total lipid yield，total lipid volumetric productivity.The results showed that the biomuss yield and total lipid contents of four microalgae were in the range of 0.099 g/（L·d）-0.201 g/（L·d）and 20.4%dw-40.1%dw，respectively，includingNannochloropsisoculata[0.201 g/（L·d），40.1%dw]，Scenedesmusdeserticola[0.099g/（L·d），30.8%dw]，Scenedesmusdimorphus[0.142g/（L·d），20.4%dw]，Chlorallazofingensis[0.155g/（L·d），29.3%dw].It was concluded that the most potential for industrial application was Nannochloropsisoculata，which lipid yield andlipidvolumetric productivity was1.409g/Land108.353mg/（L·d），respectively.The content of EPA was 7.2% dw，was the more excellent EPA production of raw materials.

Key words：microalgae；Biomass；lipid content；lipid yield；Lipid volumetric productivity；EPA