孙高英,胡礼渊,廖和菁,刘瑞芳,窦晓明,候方妮(广西东兴出入境检验检疫局,广西东兴538100)
超声萃取法检测水产品中孔雀石绿、结晶紫
孙高英,胡礼渊,廖和菁,刘瑞芳,窦晓明,候方妮
(广西东兴出入境检验检疫局,广西东兴538100)
摘要:探索了使用超声萃取水产品中孔雀石绿、结晶紫的高效液相荧光检测方法,通过试验获得最佳方案。结果表明,超声提取时间为15 min。本方法在0.5 μg/mL~800 μg/mL范围内具有很好的线性,相关系数R为0.999 9,最低检出限为0.5 μg/kg。采用不同的样品进行验证,回收率在80%~110%之间,相对标准偏差(RSD)为1%~3%。
关键词:孔雀石绿;结晶紫;超声波萃取
孔雀石绿(malachite green,MG)和结晶紫(crystal violet,CV)在水产养殖过程中,常作为抗真菌感染和杀灭寄生虫,用于防治各种鱼病[1-3]。该类物质在鱼体内代谢为隐色孔雀石绿(LMG)和隐色结晶紫(LCV)(见图1),具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变作用[4-7],且孔雀石绿在鱼体及其他生物体内会经过代谢转化成无色孔雀石绿,其危害更大,残留时间也更长,现在已被被欧美国家、日本列为不得检出的禁用药物[8-9],中国于2002年5月将孔雀石绿列为禁用药[10]。
本方法以国标GB/T20361-2006《水产品孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》为基础,结合实际,加以适当优化,建立了高效液相色谱的快速筛选方法,同时探讨测定过程中应注意的一些问题。
1.1试剂与仪器设备
1.1.1试剂
乙腈、甲醇、二氯甲烷为色谱纯;冰乙酸、盐酸羟胺、对甲苯磺酸、氨水、乙酸铵为分析纯;孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫:纯度≥98%。提取液:盐酸羟胺3 g,对甲苯磺酸0.24 g溶于100 mL水中;硼氢化钾(0.1 mol/L)现配现用;阳离子交换柱:PRS柱,500 mg、3 mL;乙酸铵缓冲溶液:称取9.64 g无水乙酸铵溶解于1 000 mL水中,用冰乙酸调pH到4.5;乙酸铵缓冲溶液(0.1 mol/L):称取0.77 g无水乙酸铵溶解于100 mL水中,用氨水调pH到10;洗脱液:乙酸铵溶液:乙腈:1∶1(体积比),临用前配制;标准储备溶液:准确称取孔雀石绿标准品,用乙腈配制成100 g/mL的标准贮备液;标准中间溶液:吸取孔雀石绿和无色孔雀石绿的标准储备溶液,用乙腈稀释成1 μg/mL,-18℃避光保存(因孔雀石绿结晶紫在常温及冷藏下均可降解[11])。
1.1.2仪器设备
1200型高效液相色谱仪(配有荧光检测器、固相萃取装置)、旋转N-1000蒸发仪:美国Agilent公司;高速离心机:时代北利DT5-1(原LD4-2A)。
1.2测定方法
1.2.1提取
称取处理好的样品约5.00g置于50mL离心管中,加入10mL的乙腈,加入酸性氧化铝5g,震荡2min,超声提取15 min,4 000 r/min离心10 min,上清液转移至125 mL分液漏斗中,在分液漏斗中加入二甘醇2 mL,3 mL硼氰化钾具塞,剧烈振摇2 min。
在50 mL离心管中继续加入1.5 mL的盐酸羟胺溶液、2.5 mL对-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸铵缓冲溶液,振荡2 min,再加入10 mL的乙腈,继续振荡2 min,超声提取15 min,4 000 r/min离心10 min,上清液并入125 mL分液漏斗中。
在分液漏斗中加入20 mL二氯甲烷,具塞剧烈振摇2 min,静置分层,将下层溶液转移至250 mL茄形瓶中,继续在分液漏斗中加入5mL乙腈,10mL二氯甲烷,振摇2min,将全部溶液转移至50mL离心管,4000r/min离心10 min,将下层溶液并入250 mL茄形瓶中,45℃旋转蒸发至近干,用3 mL乙腈溶解残渣。
1.2.2净化
将PRS柱子接到固相萃取装置上,上端接酸性氧化铝柱,先用5 mL的乙腈分两次活化柱子,转移提取液到柱上,然后用2.5 mL乙腈洗涤茄形瓶两次,依次过柱,弃去酸性氧化铝柱,吹PRS柱近干,在不抽真空的情况下,加入3 mL等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液,收集洗脱液,乙腈定容至3 mL,过0.45 μm滤膜,供液相色谱测定。
1.2.3色谱条件
色谱柱:ODS-C18、5μm、4.6mm×250mm;流动相:乙腈+乙酸铵(80+20);流速:1.3mL/min;激发波长:265nm;发射波长:360 nm;进样量:200 μL。
2.1超声提取时间的比较
分别超声5、10、15、20、25、30 min来提取水产品样品中孔雀石绿和结晶紫,测回收率,结果见图1、图2。
图1 不同萃取时间孔雀石绿的回收率比较Fig.1 Comparing different extraction time,the recovery rate of malachite green
图2 不同萃取时间结晶紫的回收率比较Fig.2 Compare the different extraction time,the recovery rate of crystal violet
结果表明:水产品样品中孔雀石绿和结晶紫的回收率在15 min最高,并且随着时间的延长变化不大,因此选择超声提取15 min最为合适。
2.2超声萃取与均质萃取步骤回收率的比较
通过测定超声萃取与均质萃取两个步骤的回收率情况,结果见表1。
表1 超声萃取与均质萃取回收率的比较Table 1 Ultrasonic extraction was compared with the homogeneous extraction recovery rate
由表1可知,超声萃取的回收率高于均质萃取,分析原因可能因为均质器上会有残留从而导致回收率偏低,使用超声节省了试验步骤,提高了回收率,降低了污染的可能性。
2.3萃取3次与萃取2次的回收率的比较
国标方法在1.2.1中萃取了3次,前处理按照超声提取后萃取2次与萃取3次进行比较,通过比较2种方法的回收率,结果见表2。
表2 萃取2次与萃取3次的回收率的比较Table 2 The recovery rate of extracting 2 times and 3 times of comparison
续表2 萃取2次与萃取3次的回收率的比较Continue table 2 The recovery rate of extracting 2 times and 3 times of comparison
由表2可知,两种处理步骤回收率差别不大,可以忽略不计,因此采用萃取2次可节省药品及前处理步骤。
2.4本方法精密度试验
取未检出含孔雀石绿、结晶紫,定量添加孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐性孔雀石绿和隐性结晶紫标准品后再进行检测,将检测值除以实际添加值,计算回收率。具体操作如下:精密称取空白鱼肉样品5.00 g,置于100 mL离心管中,按表3中的加标浓度分别准确加入一定量的混合标准溶液,充分混匀,制成不同浓度的加标样品,按1.2测定方法中的提取、净化和液相色谱条件进行试验,每一浓度平行进行6次试验,计算回收率及相对标准偏差,结果见表3。
表3 添加不同浓度的孔雀石绿与结晶紫的回收率及相对标准偏差Table 3 Adding different concentrations of malachite green and crystal violet recoveries and relative standard deviation
由表3可知,回收率在90%~101%之间,相对标准偏差在1.4%~2.5%之间。
2.5本方法线性范围及检出限
本方法在0.5 μg/mL~800 μg/mL范围内具有很好的线性,相关系数R为0.999 9,最低检出限0.5 μg/kg。
本方法根据国标方法GB/T20361-2006《水产品孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》作了部分改进,减少了样品前处理时所用步骤,从而减少了孔雀石绿、结晶紫在提取过程中的损耗,减少了试剂的使用,提高了回收率,一定程度上避免了二次污染。本方法有较大的测试线性范围和良好的精密度准确度,可为各类水产品及其制品中孔雀石绿、结晶紫残留的测定提供参考。
参考文献:
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DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.044
收稿日期:2014-02-12
作者简介:孙高英(1981—),女(汉),工程师,硕士,从事食品检验检疫工作。
Determination of Malachite Green,Crystal Violet and Their Metabolites Residues in Aquatic Product by Ultrasound-assited Extraction
SUN Gao-ying,HU Li-yuan,LIAO He-jing,LIU Rui-fang,DOU Xiao-ming,HOU Fang-ni
(Guangxi Import and Export Inspection and Quarantine Bureau,Dongxing 538100,Guangxi,China)
Abstract:This study explores the use of ultrasound-assited extraction of aquatic products of malachite green,crystal violet and HPLC fluorescence detection method,through the test to obtain the best solutions.The results showed that the ultrasound-assited extraction time is 15 min.This method has a good linear l scope between 0.5 μg/mLand800μg/mL,correlationcoefficient was0.9999,thelimitofdetectionwas0.5 μg/kg.Using different sample verification,the recovery rate is between 80%-110%,relative standard deviation(RSD)is 1%-3%.
Key words:malachite green;crystal violet;ultrasound-assited extraction