超声萃取法检测水产品中孔雀石绿、结晶紫

孙高英，胡礼渊，廖和菁，刘瑞芳，窦晓明，候方妮（广西东兴出入境检验检疫局，广西东兴538100）

超声萃取法检测水产品中孔雀石绿、结晶紫

孙高英，胡礼渊，廖和菁，刘瑞芳，窦晓明，候方妮
（广西东兴出入境检验检疫局，广西东兴538100）

摘要：探索了使用超声萃取水产品中孔雀石绿、结晶紫的高效液相荧光检测方法，通过试验获得最佳方案。结果表明，超声提取时间为15 min。本方法在0.5 μg/mL～800 μg/mL范围内具有很好的线性，相关系数R为0.999 9，最低检出限为0.5 μg/kg。采用不同的样品进行验证，回收率在80%～110%之间，相对标准偏差（RSD）为1%～3%。

关键词：孔雀石绿；结晶紫；超声波萃取

孔雀石绿（malachite green，MG）和结晶紫（crystal violet，CV）在水产养殖过程中，常作为抗真菌感染和杀灭寄生虫，用于防治各种鱼病[1-3]。该类物质在鱼体内代谢为隐色孔雀石绿（LMG）和隐色结晶紫（LCV）（见图1），具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变作用[4-7]，且孔雀石绿在鱼体及其他生物体内会经过代谢转化成无色孔雀石绿，其危害更大，残留时间也更长，现在已被被欧美国家、日本列为不得检出的禁用药物[8-9]，中国于2002年5月将孔雀石绿列为禁用药[10]。

本方法以国标GB/T20361-2006《水产品孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》为基础，结合实际，加以适当优化，建立了高效液相色谱的快速筛选方法，同时探讨测定过程中应注意的一些问题。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器设备

1.1.1试剂

乙腈、甲醇、二氯甲烷为色谱纯；冰乙酸、盐酸羟胺、对甲苯磺酸、氨水、乙酸铵为分析纯；孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫：纯度≥98%。提取液：盐酸羟胺3 g，对甲苯磺酸0.24 g溶于100 mL水中；硼氢化钾（0.1 mol/L）现配现用；阳离子交换柱：PRS柱，500 mg、3 mL；乙酸铵缓冲溶液：称取9.64 g无水乙酸铵溶解于1 000 mL水中，用冰乙酸调pH到4.5；乙酸铵缓冲溶液（0.1 mol/L）：称取0.77 g无水乙酸铵溶解于100 mL水中，用氨水调pH到10；洗脱液：乙酸铵溶液：乙腈：1∶1（体积比），临用前配制；标准储备溶液：准确称取孔雀石绿标准品，用乙腈配制成100 g/mL的标准贮备液；标准中间溶液：吸取孔雀石绿和无色孔雀石绿的标准储备溶液，用乙腈稀释成1 μg/mL，-18℃避光保存（因孔雀石绿结晶紫在常温及冷藏下均可降解[11]）。

1.1.2仪器设备

1200型高效液相色谱仪（配有荧光检测器、固相萃取装置）、旋转N-1000蒸发仪：美国Agilent公司；高速离心机：时代北利DT5-1（原LD4-2A）。

1.2测定方法

1.2.1提取

称取处理好的样品约5.00g置于50mL离心管中，加入10mL的乙腈，加入酸性氧化铝5g，震荡2min，超声提取15 min，4 000 r/min离心10 min，上清液转移至125 mL分液漏斗中，在分液漏斗中加入二甘醇2 mL，3 mL硼氰化钾具塞，剧烈振摇2 min。

在50 mL离心管中继续加入1.5 mL的盐酸羟胺溶液、2.5 mL对-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸铵缓冲溶液，振荡2 min，再加入10 mL的乙腈，继续振荡2 min，超声提取15 min，4 000 r/min离心10 min，上清液并入125 mL分液漏斗中。

在分液漏斗中加入20 mL二氯甲烷，具塞剧烈振摇2 min，静置分层，将下层溶液转移至250 mL茄形瓶中，继续在分液漏斗中加入5mL乙腈，10mL二氯甲烷，振摇2min，将全部溶液转移至50mL离心管，4000r/min离心10 min，将下层溶液并入250 mL茄形瓶中，45℃旋转蒸发至近干，用3 mL乙腈溶解残渣。

1.2.2净化

将PRS柱子接到固相萃取装置上，上端接酸性氧化铝柱，先用5 mL的乙腈分两次活化柱子，转移提取液到柱上，然后用2.5 mL乙腈洗涤茄形瓶两次，依次过柱，弃去酸性氧化铝柱，吹PRS柱近干，在不抽真空的情况下，加入3 mL等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液，收集洗脱液，乙腈定容至3 mL，过0.45 μm滤膜，供液相色谱测定。

1.2.3色谱条件

色谱柱：ODS-C18、5μm、4.6mm×250mm；流动相：乙腈+乙酸铵（80+20）；流速：1.3mL/min；激发波长：265nm；发射波长：360 nm；进样量：200 μL。

2　结果与分析

2.1超声提取时间的比较

分别超声5、10、15、20、25、30 min来提取水产品样品中孔雀石绿和结晶紫，测回收率，结果见图1、图2。

图1　不同萃取时间孔雀石绿的回收率比较Fig.1　Comparing different extraction time，the recovery rate of malachite green

图2　不同萃取时间结晶紫的回收率比较Fig.2　Compare the different extraction time，the recovery rate of crystal violet

结果表明：水产品样品中孔雀石绿和结晶紫的回收率在15 min最高，并且随着时间的延长变化不大，因此选择超声提取15 min最为合适。

2.2超声萃取与均质萃取步骤回收率的比较

通过测定超声萃取与均质萃取两个步骤的回收率情况，结果见表1。

表1　超声萃取与均质萃取回收率的比较Table 1　Ultrasonic extraction was compared with the homogeneous extraction recovery rate

由表1可知，超声萃取的回收率高于均质萃取，分析原因可能因为均质器上会有残留从而导致回收率偏低，使用超声节省了试验步骤，提高了回收率，降低了污染的可能性。

2.3萃取3次与萃取2次的回收率的比较

国标方法在1.2.1中萃取了3次，前处理按照超声提取后萃取2次与萃取3次进行比较，通过比较2种方法的回收率，结果见表2。

表2　萃取2次与萃取3次的回收率的比较Table 2　The recovery rate of extracting 2 times and 3 times of comparison

续表2　萃取2次与萃取3次的回收率的比较Continue table 2　The recovery rate of extracting 2 times and 3 times of comparison

由表2可知，两种处理步骤回收率差别不大，可以忽略不计，因此采用萃取2次可节省药品及前处理步骤。

2.4本方法精密度试验

取未检出含孔雀石绿、结晶紫，定量添加孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐性孔雀石绿和隐性结晶紫标准品后再进行检测，将检测值除以实际添加值，计算回收率。具体操作如下：精密称取空白鱼肉样品5.00 g，置于100 mL离心管中，按表3中的加标浓度分别准确加入一定量的混合标准溶液，充分混匀，制成不同浓度的加标样品，按1.2测定方法中的提取、净化和液相色谱条件进行试验，每一浓度平行进行6次试验，计算回收率及相对标准偏差，结果见表3。

表3　添加不同浓度的孔雀石绿与结晶紫的回收率及相对标准偏差Table 3　Adding different concentrations of malachite green and crystal violet recoveries and relative standard deviation

由表3可知，回收率在90%～101%之间，相对标准偏差在1.4%～2.5%之间。

2.5本方法线性范围及检出限

本方法在0.5 μg/mL～800 μg/mL范围内具有很好的线性，相关系数R为0.999 9，最低检出限0.5 μg/kg。

3　讨论

本方法根据国标方法GB/T20361-2006《水产品孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法》作了部分改进，减少了样品前处理时所用步骤，从而减少了孔雀石绿、结晶紫在提取过程中的损耗，减少了试剂的使用，提高了回收率，一定程度上避免了二次污染。本方法有较大的测试线性范围和良好的精密度准确度，可为各类水产品及其制品中孔雀石绿、结晶紫残留的测定提供参考。

参考文献：

[1]Hoffman G L,Meyer P.E Parasites of freshwater fishes[J].TFH Publications,Neptune,New Jersey,1974(5):301-305

[2]Alderman D J.Malachite green:Review[J].Fish Dis,1985(8):289,298

[3]Schnick R A.Malachite green:Review[J].Fish Cult,1988(50):190, 196

[4]Meyer F Jorgensen T A.Toxicological and other effects of malachite green on development of rainbow trout and rabbits[J].Trans Am Fish Soc,1983,112(6):818-824

[5]Femandes C,Lalitha V S,Ran V K.Enhancing effect ofmalachite green on development of hepatic pre·neoplastic lesions induced byN-nitrosodiethylamine in rats[J].Carcinogenesis,1991(12):839-845

[6]Rao K V K.Inhibition of DNA synthesis in primary rat hepatocyte cultures by malachite green:a new liver tamor promoter[J].Toxicology letters,1995,81(23):107-113

[7]Gouranchat C.Malachite green in fish culture(state of the art and perspectives)[R].Bibliographic studies.Vetefinaire ENVT Nantes France:Ecole Natl,2000:142

[8]孙满义,杨贤庆,岑剑伟,等.水产品中孔雀石绿的研究进展[J].食品工业科技,2009,30(2):312-315

[9]彭贞,郑玉琴.孔雀石绿与蛋白质相互作用的电化学行为的研究[J].化学试剂,2009,31(1):49-51

[10]中华人民共和国农业部.食品动物禁用的兽药及其他化合物清单[Z].中华人民共和国农业部第193号公告,2002

[11]穆迎春,邢丽红,马兵,等.不同贮藏条件下孔雀石绿加标样品降解研究[J].中国农学通报,2012,28(2):83-89

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.044

收稿日期：2014-02-12

作者简介：孙高英（1981—），女（汉），工程师，硕士，从事食品检验检疫工作。

Determination of Malachite Green，Crystal Violet and Their Metabolites Residues in Aquatic Product by Ultrasound-assited Extraction

SUN Gao-ying，HU Li-yuan，LIAO He-jing，LIU Rui-fang，DOU Xiao-ming，HOU Fang-ni
（Guangxi Import and Export Inspection and Quarantine Bureau，Dongxing 538100，Guangxi，China）

Abstract：This study explores the use of ultrasound-assited extraction of aquatic products of malachite green，crystal violet and HPLC fluorescence detection method，through the test to obtain the best solutions.The results showed that the ultrasound-assited extraction time is 15 min.This method has a good linear l scope between 0.5 μg/mLand800μg/mL，correlationcoefficient was0.9999，thelimitofdetectionwas0.5 μg/kg.Using different sample verification，the recovery rate is between 80%-110%，relative standard deviation（RSD）is 1%-3%.

Key words：malachite green；crystal violet；ultrasound-assited extraction