食品中三聚氰胺的快速检测方法

于燕燕，杜　峰，王　娜（.天津出入境检验检疫局，天津300308；.国家知识产权局专利局专利审查协作天津中心，天津300308）

食品中三聚氰胺的快速检测方法

于燕燕1，杜峰2，王娜1
（1.天津出入境检验检疫局，天津300308；2.国家知识产权局专利局专利审查协作天津中心，天津300308）

摘要：三聚氰胺是一种广泛用于塑料、造纸和肥料的化工原料，若添加到食品中并长期被人们摄入会严重影响到身体健康。目前，用于三聚氰胺检测的方法主要有：高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法、电色谱仪检测法等，但是，这几种检测方法均需要采用氮气吹干仪，存在不能一次处理大量样品、有毒气体污染环境、消耗大量氮气的技术问题。本文创新了一种新的检测设备“真空离心浓缩仪”，同时优化了检测方法，能够快速检测三聚氰胺，同时具有以下优点：可同时处理多个样品而不会导致交叉污染；可以回收甲醇等有毒气体，减少环境污染；回收的甲醇经蒸馏处理后可以重复使用，降低了成本。

关键词：食品；三聚氰胺；真空离心浓缩；检测技术

三聚氰胺（Melamine）简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，广泛用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业中。蛋白质的平均含氮质量分数为16．6%，而三聚氰胺的含氮质量分数高达66．6%。由于全氮法测定蛋白质含量时不能区分这种“伪蛋白氮”，所以一些不法商家将其添加到食品中以提高蛋白质含量。三聚氰胺不能被人体代谢，严重损害了消费者的健康和利益，尤其是儿童，服用三聚氰胺超标的食品，会导致肾结石[1-4]。“三鹿奶粉事件”导致大量儿童肾结石，以三鹿，蒙牛，伊利等为首的乳品企业均在其产品内检出超标的三聚氰胺，一时间引起了人们对三聚氰胺的高度关注，随之，国家取消了食品类商品免检的待遇，这直接导致三聚氰胺的检测量大增。

目前，国家标准GB/T22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺的检测方法》规定了三聚氰胺的检测方法[5]，实验室检测方法主要有：高效液相色谱法[6]、液相色谱-质谱法[7-9]、气相色谱-质谱法等，奶制品中也有采用酶联免疫吸附法检测[10]。另外，目前一些检测机构提出采用电色谱仪进行检测[11]。针对这些检测方法，液相色谱法的灵敏度较低，且分析时间较长，气质、液质联用仪，电色谱仪虽然检测灵敏度和分辨率很高，但是，这几种检测方法均需要采用氮气吹干仪，氮气吹干仪处理三聚氰胺样品虽然能够较快的处理样品，但是，氮气吹干仪一次只能处理少量样品，增加了检测时间，无法满足目前大量检测样品需同时检测的需求；从试管内被氮气吹扫而挥发出来的有机溶剂不经任何处理，直接散发到周围环境中，这些溶剂常常是强酸、强碱以及强腐蚀性物质。直接操作的实验人员极易因此出现健康问题，而这些溶剂挥发到空气里，也会对周围环境造成危害，包括办公室工作人员，周围绿化等。蒸汽会腐蚀仪器（针头），导致交叉污染；另外，氮气吹干仪本身于由于长期处在这种环境中，也会很快出现生锈等被腐蚀现象，虽然有些氮气吹干仪的设计将针头包上一层PTFE以防腐，但针的尾部和仪器其它部件无法全部包上PTFE，不仅影响美观、性能，而且在操作时稍有不慎，便会将铁锈等碰落到样品中，造成样品污染；氮气吹干操作麻烦，必须有人一直看守，增加了检测人员的负担；消耗大量氮气，增加检测成本。由此可见，改进氮气吹干仪在三聚氰胺检测中的缺陷是非常必要的[12]。

本文创新了一种新三聚氰胺的检测设备“真空离心浓缩仪”，同时优化了检测方法，解决了目前检测方法存在的不能一次处理大量样品，有毒气体污染环境，消耗大量氮气的技术问题。

1　试验部分

1.1仪器与试剂

安捷伦7890A/5975C气相色谱-质谱检测系统（配备混合型阳离子交换固相萃取柱）：美国安捷伦公司；CHRIST SpeedDry 2-33IR真空离心浓缩仪：德国CHRIST公司。

乙酸铅（分析纯）、三氯乙酸、甲醇（色谱级）、优纯级吡啶、N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷、三聚氰胺，以上试剂均由天津化学试剂有限公司提供。1.2试验条件

GC-MS色谱条件：色谱柱：5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛细管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；流速：1.0 mL/min；程序升温：70℃保持1min，以10℃/min的速率升温至200℃，保持10 min；传输线温度：280℃；进样口温度：250℃；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL；电离方式：电子轰击电离（EI）；电离能量：70 eV；离子源温度：230℃；扫描模式：选择离子扫描，定性离子m/z 99、171、327、342，定量离子m/z 327。

1.3方法

1.3.1三聚氰胺标准溶液配制

三聚氰胺标准储备液的配制：准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100 mL容量瓶中，用质量分数为50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存。

三聚氰胺标准溶液的配制：取三聚氰胺标准储备液0.01、0.02、0.2、0.4、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，用质量分数为50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1.0、20.0、40.0、80.0、100.0 mg/L的标准溶液，于4℃冰箱内储存，有效期3个月。

1.3.2样品的提取

液态奶、奶粉、酸奶和奶糖等称取5.00 g样品于50 mL具塞比色管，加入30 mL浓度1%（质量分数）的三氯乙酸溶液，涡漩振荡40 s以上，再加入10 mL浓度1%（质量分数）三氯乙酸溶液，超声提取20 min以上，加入2 mL、浓度22 g/L的乙酸铅溶液，用1%（质量分数）三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混匀后，转移上层提取液29 mL～32 mL至50 mL的离心试管，以5 000 r/min离心15 min以上，得到待净化的上清液。

奶酪、奶油和巧克力等称取5.00 g样品于50 mL具塞比色管中，用5 mL热水溶解或者在加热的条件下溶解，再加入25 mL浓度1%（质量分数）的三氯乙酸溶液，涡漩振荡40 s以上，再加入10 mL三氯乙酸溶液超声提取20 min以上，加入2 mL、浓度22 g/L的乙酸铅溶液，用1%（质量分数）三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混匀后，转移上层提取液29 mL～32 mL至50 mL的离心试管，以5 000 r/min离心15 min以上，得到待净化的上清液。

1.3.3上清液的净化

取基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物的混合型阳离子交换固相萃取柱，先依次用3 mL～4 mL甲醇、5 mL～6 mL水活化；移取5 mL的待净化滤液至固相萃取柱中。再用3 mL～5 mL水、3 mL～5 mL甲醇淋洗，淋洗液送入回收装置，抽近干后用3 mL～5 mL体积分数5%的氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；所述氨化甲醇是5 mL摩尔浓度为25%～28%的氨水和95 mL甲醇，混匀后备用。

1.3.4离心浓缩

将12～24份（样品量调整到偶数，单数量样品可以用空的离心管配级成偶数）样品收集得到的洗脱液同时放入到真空离心浓缩仪的离心管中，进行真空离心干燥，在真空状态下辐射加热样品；并利用真空离心浓缩仪的冷阱捕捉溶剂蒸气，冷却，回收，送入回收装置。

所述真空离心浓缩仪主要由：离心主机、冷阱、真空泵三部分组成，这算是一种在真空状态下离心样品，从而将溶剂蒸发以浓缩或干燥样品的仪器。并通过超低温的冷阱捕捉溶剂。离心浓缩后的样品可方便的用于各种定性和定量的分析。离心浓缩技术融合了离心、抽真空和热量3种因素，用于有效的蒸发各种溶剂。

离心：转速1 000 r/min，防止爆沸及样品的损失。干燥后的溶质完全沉积在容器的底部，便于样品的完全回收。

抽真空：加速溶剂在SpeedVac浓缩仪中的蒸发。在浓缩过程中，样品始终处于一种低于室温的环境，可以防止热敏感样品的部分失活。此外，真空状态还能防止样品的氧化。

热量：加速样品的蒸发速率。在没有外来热量的状态下，水溶液会在浓缩过程中结冰，本设备采用辐射加热技术，弥补蒸发时的热量损耗。热辐射是真空状态下给样品加热的最有效方式。

1.3.5衍生化

取上述干燥残留物，加入600 μL的优纯级吡啶和200 μL衍生化试剂，混匀，70℃反应40 min以上；所述衍生化试剂是由体积比99∶1的N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）和三甲基氯硅烷（TMCS），其中所述衍生化试剂是色谱纯的。

1.3.6三聚氰胺的定量检测

称取样品5 g按上述方法处理后进行空白试验，取样品5 g加入适量三聚氰胺标准液处理后按上述方法进行GC-MS测定，以标准工作溶液浓度为横坐标，定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。比对标准曲线，即得到样品中三聚氰胺的含量。

2　结果分析

2.1标准曲线

对浓度为1.0、20.0、40.0、80.0、100.0 mg/L的三聚氰胺标准溶液分别进样，以标准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（见图1）。

图1　标准溶液的标准曲线Fig.1　The standard curve of the standard solution

三聚氰胺在1.0 mg/L～100 mg/L浓度范围内线性关系良好，回归方程：y=39.24x+5.056 7（y为样品峰面积，x为样品浓度），相关系数r=0.999 8。

2.2方法的准确度及精密度分析

称取空白牛奶5 g进行空白试验，加入3个不同浓度的三聚氰胺标准液处理后进行分析，每个样品重复分析3次，回收率范围89.0%～105.0%，相对标准偏差3.14%～4.97%，其准确度与精密度均符合残留分析的要求。样品添加回收率见表1。2.3甲醇回收率试验

表1　方法回收率试验Table 1　The average recoveries of the rapid screening method

称取不同量奶粉，按照本文方法处理，分别使用5、20、50 mL的甲醇进行处理，得到洗脱液放入到甲醇蒸馏装置中，得到纯化的甲醇，甲醇的回收率在85%（质量分数）以上，重复利用率为80%（质量分数）以上。

3　结论

采用本文所述方法检测三聚氰胺具有以下优点：

a）真空浓缩仪综合利用离心力、加热和外接真空泵提供的真空作用来进行溶剂蒸发，可同时处理多个样品而不会导致交叉污染。

b）冷阱能有效捕捉大部分对真空泵有损害的溶剂蒸气，对高真空油泵提供有效的保护。

c）真空泵使系统处于真空状态，降低溶剂的沸点，加快溶剂的蒸发速率。

d）可以同时处理大量样品，最大可以同时处理24份样品，并可同时处理多种样品。

e）可以回收甲醇，最大可能的降低环境污染，回收的甲醇经蒸馏处理后可以重复使用，甲醇的重复利用率达80%以上，降低了成本。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.038

收稿日期：2015-05-15

基金项目：获得授权发明专利：ZL201210402734.3一种三聚氰胺的检测方法；实用新型专利：ZL201220540231.8一种三聚氰胺的检测装置

作者简介：于燕燕（1981—），女（汉），中级工程师，硕士研究生，主要从事出入境检验检疫工作。

Research of Rapid Detection of Melamine in Food

YU Yan-yan1，DU Feng2，WANG Na1
（1.Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300308，China；2.Patent Examination
Cooperation Tianjin Center of The Patent Office，SIPO，Tianjin 300308，China）

Abstract：Melamine is widely used as raw material in various industries including plastics，papers and fertilizers，which can do harm to people's health if it is added to food.These incidents have promoted the development of various methods for detecting melamine in many kinds of food products，including highperformance liquid chromatography，gas chromatography，liquid chromatography-mass spectrum，gas chromatography-mass spectrum，and capillary electrophoresis，etc.However，Termovap Sample Concentrator is Indispensable for these detection measurements in which with the consuming large amounts of nitrogen and lacking the ability of dealing with large numbers of samples simultaneously and generating toxic gases byproduct which will pollute the environment.A new detection equipment"vacuum centrifugal concentrator"was innovated in this paper，while the detection method was optimized.This method can realize the rapid detection of melamine，also has the following advantages：it can simultaneously process a plurality of samples without cross contamination；methanol and other toxic gases can be recycled to reduce environmental pollution，recycling methanol can be reused after distilled treatment，by which can also reduce the cost.

Key words：food；melamine；vacuum centrifugal concentration；detection method