响应面法优化固定化果胶酶制备黑莓汁工艺

丁爱凤，黄卉卉，孙嘉文，谢惠惠（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京210003）

响应面法优化固定化果胶酶制备黑莓汁工艺

丁爱凤，黄卉卉，孙嘉文，谢惠惠
（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京210003）

摘要：利用固定化果胶酶处理黑莓浆，可以提高黑莓的出汁率，降低生产成本，提高企业经济效益。在单因素试验基础上，通过Design-Expert软件进行影响因素响应面分析，优化固定化果胶酶制备黑莓汁的工艺条件。结果显示，影响因素的影响大小顺序为：固定化果胶酶水解温度＞固定化果胶酶水解时间＞固定化果胶酶使用质量＞黑莓pH；响应面分析试验得到黑莓出汁率回归方程，方程达到极显著水平（F=50.48；P<0.000 1），拟和很好（R2Pred=0.794 5；R2Adj= 0.965 3）；固定化果胶酶制备黑莓汁优化工艺参数为：30 g黑莓浆使用固定化果胶酶为5 g、固定化果胶酶水解时间为1.0 h、固定化果胶酶水解温度为52℃；利用优化工艺，平均黑莓出汁率达到70.83%。固定化果胶酶重复使用13次，第13次黑莓出汁率为65.91%（对照组62.37%）。

关键词：固定化果胶酶；出汁率；黑莓汁；响应面分析

新鲜黑莓储藏困难，货架期短，很容易发生腐烂[1-3]。因此，将黑莓加工成各种食品，不仅可以降低因腐败而造成的经济损失，还可提高黑莓的附加值[4-6]。黑莓制成果汁饮料时多数加工成澄清汁，也有加工成果茶、果肉饮料和混合饮料[4-6]。

黑莓成熟期间水溶性多糖醛酸苷从30%增加到65%，半纤维素也发生降解，使黑莓在破碎后成胶粘状，直接榨汁困难，出汁率低，果汁浑浊不清，且大量的果胶物质进入原汁会造成澄清等后续工序的难度加大[4-8]。

固定化酶与游离酶相比，固定化酶稳定性有较大提高，对温度和pH的适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低；酶可以多次重复使用，也便于产品的分离和纯化；实现批量或连续操作模型的可能，适于产业化、连续化、自动化生产；可以降低生产成本。

目前，鲜见利用固定化果胶酶提高黑莓出汁率的报道。本研究采用固定化果胶酶处理黑莓浆，提高黑莓出汁率，为固定化果胶酶在黑莓汁生产中的应用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

红颜黑莓：南京市溧水区傅家边；固定化果胶酶（256 U/g）：南京财经大学生物工程系。

1.2仪器与设备

SQ 2008型多功能食品加工机：上海帅佳电子科技有限公司；80-2型离心机：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；CHA-S型恒温振荡器：国华企业；PHS-3C型精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；YJ501型超级恒温器：上海跃进医疗器械厂。

1.3方法

1.3.1黑莓浆的制备

选取新鲜、无害虫、无霉烂的黑莓，清洗沥干后去梗，用打浆机将黑莓打浆3次，每次10 s，得到黑莓浆。

1.3.2固定化果胶酶对黑莓出汁率的影响

称取30 g黑莓浆，加入一定质量的固定化果胶酶，在55℃下振荡反应一定时间后，取出固定化果胶酶，将处理后黑莓浆在3 600 r/min下离心16 min，测定沉淀的黑莓渣质量，计算其出汁率。

式中：Y为出汁率，%；A为黑莓浆重，g；B为黑莓渣重，g。

1.3.2.1固定化果胶酶使用质量对黑莓出汁率的影响

称取黑莓浆，每份30 g，分别加入0、1、2、3、4、5 g固定化果胶酶，在55℃下振荡水解1 h，然后按照1.3.2操作，设计平行试验。计算黑莓浆的出汁率（以未加果胶酶为对照组）。

1.3.2.2水解时间对黑莓出汁率的影响

称取黑莓浆，每份30 g，加入最适宜质量的固定化果胶酶，在55℃下分别振荡水解0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，然后按照1.3.2操作，设计平行试验。计算黑莓浆的出汁率（以未加果胶酶为对照组）。

1.3.2.3水解温度对黑莓出汁率的影响

称取黑莓浆，每份30 g，加入一定量固定化果胶酶，分别在45、50、55、60、65℃振荡水解1 h，然后按照1.3.2操作设计平行试验。计算黑莓浆的出汁率（以未加果胶酶为对照组）。

1.3.2.4黑莓浆pH对黑莓出汁率的影响

称取黑莓浆，每份30 g，分别调pH为3.2、3.4、3.6、3.8和4.0，然后按照1.3.2操作。计算黑莓浆的出汁率（未调节pH的天然黑莓浆pH 3.48，加果胶酶，以其作为对照组）。

1.3.3响应面优化固定化酶水解工艺参数试验

根据单因素试验结果，以固定化果胶酶使用质量（A）、固定化果胶酶水解时间（B）和固定化果胶酶水解温度（C）为影响因子进行响应面设计，因素水平见表1。

表1　响应面优化试验因素水平表Table 1　Factors and levels in the response surface design

以黑莓出汁率为响应值，利用Design-Expert 6.0.5软件对Box-Behnken中心组试验数据进行回归分析，确定固定化果胶酶制备黑莓汁的工艺。

2　结果与分析

2.1固定化果胶酶使用质量对黑莓出汁率的影响

固定化果胶酶使用质量对黑莓出汁率的影响见图1。

图1　固定化果胶酶的使用质量对黑莓出汁率的影响Fig.1 Effect of immobilized pectinase application amount on blackberry juice yield

由图1可知，对照组的出汁率为62.10%，而试验组的出汁率都大于对照组。随着固定化果胶酶的使用质量的增加，黑莓出汁率也增加，在固定化果胶酶使用量4 g时，黑莓出汁率达到74.56%，这时固定化果胶酶与黑莓浆的质量比为1∶7.5。当固定化果胶酶使用质量大于4 g以后，黑莓出汁率无明显变化。

2.2固定化果胶酶水解时间对黑莓出汁率的影响

固定化果胶酶水解时间对黑莓出汁率的影响见图2。

图2　固定化果胶酶水解时间对黑莓出汁率的影响Fig.2　Effect of immobilized pectinase reaction time on blackberry juice yield

由图2可知，固定化果胶酶对黑莓浆的处理时间小于1.0 h时，随着时间的增加，黑莓出汁率明显增加；在1.0 h时，黑莓出汁率达到72.80%，然后随着时间的增加，黑莓出汁率基本不变，而对照组的出汁率为62.11%。

2.3固定化果胶酶水解温度对黑莓出汁率的影响

固定化果胶酶水解温度对黑莓出汁率的影响见图3。

图3　固定化果胶酶水解温度对黑莓出汁率的影响Fig.3　Effect of immobilized pectinase reaction temperature on blackberry juice yield

由图3可知，在试验温度范围内，对照组出汁率约为62.13%，而试验组的出汁率高于对照组。在40℃～55℃范围内，随着果胶酶水解温度提高，黑莓出汁率不断提高，55℃水解时出汁率达到最高为72.86%。水解温度大于55℃时，出汁率开始下降。

2.4黑莓浆pH对黑莓出汁率的影响

黑莓浆pH对黑莓出汁率的影响见图4。

由图4可知，试验组在试验pH范围内，出汁率最大为72.38%（pH 3.4），最小为72.19%（pH 4.0）。对照组（pH 3.48）固定化果胶酶水解天然黑莓浆的出汁率为72.32%。由此可见，在试验pH范围内，黑莓浆的酸度对固定化果胶酶水解能力影响很小。

图4　黑莓浆pH对黑莓出汁率的影响Fig.4　Effect of blackberry juice pH on blackberry juice yield

2.5固定化果胶酶提高黑莓出汁率工艺参数的优选

2.5.1响应面优化试验设计与结果

根据上述单因素试验结果，选用固定化果胶酶使用质量、固定化果胶酶水解时间和固定化果胶酶水解温度三个影响因子，利用Box-Benhnken中心组合试验设计原理，设计了三因素三水平的响应面分析试验。共17个试验，包括12个析因试验和5个检验误差的零点试验。试验设计与结果见表2。

表2　响应面试验设计及结果Table 2　Response surface design matrix and the experimental and the predicted values of the apple juice yield

2.5.2黑莓出汁率模型及可信度

利用软件SAS程序对出汁率进行回归分析，经过回归拟和得到出汁率（Y）与3个因素二次多项回归方程模型：Y=72.736+0.691 25A+0.731 25B-0.141C-0.85675A2-2.35675B2-3.65925C2-0.2725AB+0.27AC+ 0.815BC。

模型方程表达了黑莓出汁率与所选3个因素之间的关系，方程中各项系数的绝对值反映各因素对出汁率的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。模型可信度分析见表3。

表3　模型可信度分析Table 3　Model analysis of reliability

由表3可知，R2Pred为0.794 5，而R2Adj为0.965 3，因此该模型具有相当高的拟合度。信噪比Rsn为21.761，远大于4.0，模型的可信度很高。

2.5.3黑莓出汁率模型显著性分析

利用Design-expert分析软件，对回归方程模型进行方差分析，结果见由表4。

表4　响应面二次回归方程模型方差分析结果Table 4　Analysis of variances for the developed quadratic regression model

由表4可知，模型具有高度的显著性（F=50.48；P< 0.000 1）；相对于纯误差来说，失拟（F=0.051 0）不显著。因此，该模型可以用来实验预测。

若P值小于0.05表明影响因子有显著影响；若P值大于0.1说明影响因子没有显著影响。由表4可知，固定化果胶酶使用质量（P=0.008 2）、固定化果胶酶水解时间（P=0.006 2）、固定化果胶酶水解温度（P= 0.000 1）和固定化果胶酶水解时间与固定化果胶酶水解温度的交互作用（P=0.018 8）对黑莓出汁率有显著影响。该模型中3个因素的影响顺序为：固定化果胶酶水解温度＞固定化果胶酶水解时间＞固定化果胶酶使用质量。

2.5.4响应面分析

根据回归方程模型，导出响应面曲面图，详见图4～图6，3组图直观地反映了各因素对黑莓出汁率的影响。

图4　固定化果胶酶使用质量和水解时间对出汁率影响Fig.4　Effect of quality and hydrolysis time of immobilized pectinase on juice yield

图5　固定化果胶酶使用质量和水解温度对出汁率影响Fig.5　Effect of quality and hydrolysis temperature of immobilized pectinase on juice yield

图6　固定化果胶酶水解温度和水解时间对出汁率影响Fig.6　Effect of quality and hydrolysis temperature of and hydrolysis time of immobilized pectinase on juice yield

由图4可知，在固定化果胶酶使用质量一定时，酶水解时间在-1～+0.5水平范围内，随着水解时间增加，黑莓出汁率快速增加，在+0.5水平时，出汁率达到最大；而水解时间在+0.5～+1水平范围内，随着水解时间延长，黑莓出汁率开始缓慢下降。在水解时间一定时，固定化果胶酶使用质量在-1～+0.5水平范围内，随着酶使用质量的增加，出汁率也随之增加，在+0.5水平时，出汁率达最大；而酶使用质量在+0.5～+1水平范围内，随酶使用质量增加，出汁率出现缓慢下降。

由图5可知，在酶水解温度一定时，固定化果胶酶使用质量在-1～+0.5水平范围内，随着使用质量的增加，黑莓出汁率也增加，在+0.5水平时，出汁率达到最大；而酶使用质量在+0.5～+1水平范围内，随着酶使用质量的增加，出汁率基本处于相同水平。在固定化果胶酶使用质量一定时，酶水解温度在-1～0水平范围内，随着水解温度的提高，黑莓出汁率随之增加，在0水平时，出汁率达最大；水解温度在0～+1水平范围内，随水解时间延长，黑莓出汁率快速下降。

由图6可知，在酶水解时间一定时，酶水解温度在-1～0水平范围内，随着水解温度提高，黑莓出汁率逐渐提高，在0水平时，出汁率达到最大；在酶解温度0～+1水平范围内，随着水解温度的提高，出汁率逐渐下降。在酶水解温度一定时，酶水解时间在-1～+0.5水平范围内，随着水解时间增加，黑莓出汁率逐步增加，在+0.5水平附近，出汁率达最大；在水解时间+0.5～+1水平范围内，随着水解时间增加，出汁率缓慢下降。

为了进一步确定3个因素对出汁率的影响，对所得方程进行逐步回归，回归模型存在稳定点编码值（+1.00，+0.07，-0.15），稳定点的特征值表明为稳定点的目标点，即最佳工艺参数为：在30 g黑莓浆中固定化果胶酶使用质量为5 g、固定化果胶酶水解时间为1.04 h、固定化果胶酶水解温度为52.25℃，在此条件下，出汁率预测值为71.67%。为了便于实际操作，生产过程中确定30 g黑莓浆使用固定化果胶酶为5 g、固定化果胶酶水解时间为1.0 h、固定化果胶酶水解温度为52℃。

2.6优化工艺验证试验和固定化果胶酶重复试验

按照修订的优化工艺参数，共进行8样本平行试验，平均黑莓出汁率达到70.83%，与预测得率71.67%有很好吻合度。

2.7固定化果胶酶重复试验

固定化果胶酶间断重复使用13次，第13次时黑莓出汁率为65.91%，仍高于对照组62.37%。

3　结论

采用固定化果胶酶水解黑莓浆，经过回归拟和得到黑莓出汁率（Y）与固定化果胶酶使用质量、水解时间和水解温度等3个因素二次多项回归方程模型：Y= 72.736+0.691 25A+0.731 25B-0.141C-0.856 75A2-2.356 75B2-3.659 25C2-0.272 5AB+0.27AC+0.815BC。

模型方程达到极显著水平，拟和度高，在试验设计的范围内可以对黑莓出汁率进行有效预测。

影响固定化果胶酶制备黑莓汁的因素顺序为：固定化果胶酶水解温度＞固定化果胶酶水解时间＞固定化果胶酶使用质量。而黑莓浆pH，在试验范围内对固定化果胶酶水解能力影响极小。

固定化果胶酶制备黑莓汁的优化工艺为：30 g黑莓浆使用固定化果胶酶为5 g、固定化果胶酶水解时间为1.0 h、固定化果胶酶水解温度为52℃。平均黑莓出汁率达到70.83%。

固定化果胶酶间断重复使用，第13次时黑莓出汁率为65.91%，而对照组为62.37%。

参考文献：

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[2]赵慧芳,吴文龙,姚蓓,等.黑莓复合果汁的研制[J].食品与机械, 2013(5):208-212

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[4]赵慧芳,吴文龙,姚蓓,等.黑莓果浆酶解工艺研究[J].食品工业, 2013,34(5):40-43

[5]周剑忠,单成俊,张丽霞,等.黑莓果肉饮料生产工艺研究[J].江西农业学报,2014,26(2):155-157

[6]王金华,王玉,马立志.黑莓蓝莓复合浊汁饮料加工技术研究[J].食品研究与开发,2015,36(3):35-38

[7]赵龙,卢慧,王秀丽.黑莓浓浆饮品的加工工艺研究[J].食品工业科技,2014(3):233-236

[8]周剑忠,单成俊,黄自苏,等.黑莓浓缩清汁加工工艺研究[J].江苏农业科学,2014,42(7):263-265

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.029

收稿日期：2015-05-26

基金项目：江苏省大学生实践创新项目(W_DCX12001)

作者简介：丁爱凤（1972—），女（汉），讲师，本科，研究方向：食品工程。

Process Optimization of Blackberry Juice Preparation on Immobilized Pectinase by Response Surface

DING Ai-feng，HUANG Hui-hui，SUN Jia-wen，XIE Hui-hui
（College of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210003，Jiangsu，China）

Abstract：Blackberry pulp was hydrolyzed with the immobilized pectinases，which could improve the blackberry juice yield，reduce production cost and increase the economic efficiency of enterprises.The process condition of blackberry juice which produced in immobilized pectinases was optimized through the response surface analysis of influence factor by Design-Expert software on the basis of single factor experiment.The result indicated that the effect of the hydrolysis temperature of the immobilized pectinases was greater than that of the hydrolysis time of the immobilized pectinases，the amount of the immobilized pectinases and，the pH of blackberry pulp，and the effect of the pH of blackberry pulp was the minimum during four influence factors；the regression equation of blackberry juice rate was established in the response surface analysis of the effect factors，the equation reached the extremely significant level（F=50.48；P<0.000 1）and good agreement（R2Pred=0.794 5；R2Adj=0.965 3）；The optimization process parameters which the immobilized pectinases produced blackberry juice as follow：30 g blackberry pulp，5 g immobilized pectinases，the immobilized pectinases hydrolysis time for 1 hour，the immobilized pectinases hydrolysis temperature of 52℃，in which the average juice yield of blackberry was 70.83%.The immobilized pectinases was used for 13 times，blackberry juice yield was 65.91% at the thirteenth（control group 62.37%）.

Key words：immobilized pectinase；juice yield；blackberry juice；response surface analysis