超声波辅助法提取毛葱黄酮的工艺研究

刘　超，高炯杰（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林132101）

超声波辅助法提取毛葱黄酮的工艺研究

刘超，高炯杰
（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林132101）

摘要：以毛葱为原料，利用乙醇在超声波辅助下提取毛葱黄酮，经AB-8大孔吸附树脂纯化，通过三氯化铝和浓氨水定性试验，确定所制备的产品为纯度较高的毛葱黄酮。通过考察影响黄酮得率的主要3个因素乙醇浓度，超声时间，超声温度，利用响应面法确定毛葱黄酮的最佳提取工艺为：乙醇浓度为85.12%，提取温度为61.11℃，提取时间28.2 min，黄酮提取率达到2.024%。

关键词：毛葱；黄酮；乙醇提取；响应面法

分蘖葱头，为百合科葱属植物（Allium cepa L.var. Agrogatum Don），多年生草本，其鳞茎近似球形，外包赤红色皮膜，出叶后根部呈6～14个葱头，属高产作物，适宜黑土地生长，在黑龙江中北部、吉林大部分地区都能种植这种作物，可间作，生育期58 d，不怕冻，产量高。分蘖葱头具有抑菌、降血糖、抑制血小板凝聚、降血脂、降血糖等生理功能[1-2]。其已被专家们发现至少有6种抗癌防衰老降脂作用的成分；对脑瘤、乳腺、前列腺等疾病都有很好的治疗作用，特别是软化脂肪中的血管治疗更佳。世界各专业教授和性病专家们研究发现：把毛葱经过特殊加工后所取得的毛葱汁（学术界称之为毛葱油），还可以阻断结肠、口腔、肺、肝脏胰腺、食管癌过程都有明显的治疗作用，在东南亚国家，各自家庭中把毛葱自然加工后取汁，经常食用还可刺激正常免疫，阻断宫颈癌和皮肤癌细胞的生长[3]。

葱属植物中的黄酮醇类成分主要为山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）与葡萄糖组成的单糖苷至多糖苷。Ngocly T.等[4]于2005年从洋葱皮中发现了3个新的槲皮素缩合物，分别为槲皮素和原儿茶酸的缩合物、槲皮素氧化物和4-O-吡喃葡萄糖-槲皮素的缩合物以及槲皮素三聚物。2006年，Freddy A.等[5]又从洋葱皮中发现了4个槲皮素B环上的氧化产物，这些化合物具有较强的抗氧化活性。

葱属植物对心血管系统疾病具有较强的治疗作用，特别是其抗血小板聚集作用国内外文献中有较多报道。Alfonso C.等分别从A.neapolitanum[6]和A.ursinum[7]中得到7种新黄酮醇苷，对血小板聚集均有不同程度的抑制作用；2003年，Furusawa M.等[8]从洋葱皮中提取得到的4个黄酮醇可抑制人的血小板聚集，其中槲皮素及其二聚物还可使ADP引起的聚合物分解，从而有效预防了动脉粥样硬化的发生；Lytn和Hazama C等[9]从洋葱中分离9种黄酮类化合物，并研究了其抗氧化性作用；我国研究人员李鹏等[10]测定了分蕖葱头中提取的黄酮化合物的抗氧化活性，证明其具有显著的抗氧化活性。

本文采用超声波辅助法提取毛葱黄酮，其提取溶剂是乙醇，对超声时间、超声温度、乙醇浓度3个因素进行试验，并在单因素的试验基础上，采用响应面法对超声波辅助法提取毛葱黄酮的工艺进行优化，得出超声波辅助法提取毛葱黄酮的最佳提取工艺，为今后的提取毛葱黄酮等活性物质拥有更佳的方法打基础。响应面分析法是一种优化工艺条件的有效方法，与正交试验设计相比，具有试验周期短，求得回归方程精度高，可用于确定试验因素及其交互作用在工艺过程中对指标响应值的影响等。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

分蘖葱头：4月采于吉林市左家山区。

1.2仪器与设备

FA2004型精密电子天平：天津天马衡基仪器有限公司；752N紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；BILON-650CT超声波提取仪器：上海比朗仪器制造有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机：上海谷宁仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；EYELA N-1100旋转蒸发仪：郑州长科工贸有限公司。

1.3方法

1.3.1醇提法提取毛葱黄酮

称取切好的毛葱100 g，置入95%的乙醇300 mL，在50℃下回流提取2次，每次1 h，过滤，合并2次滤液，减压浓缩，用石油醚脱脂，除去色素和脂溶性成分，冷冻干燥，得粗提物，称量备用。

1.3.2超声波辅助法提取毛葱黄酮

称取切好的毛葱100 g，置入95%的乙醇300 mL，浸泡12 h，再用超声波辅助提取30 min，过滤，减压浓缩，用石油醚脱脂，除去色素和脂溶性成分，冷冻干燥，得粗提物，称量。比较两次粗提物的重量，选择合适的方法提取黄酮。

1.3.3AB-8大孔吸附树纯化毛葱黄酮

将干燥好的提取物，用50℃的热水溶解浸膏，放入50 mL的容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度；缓慢将溶液放入到大孔树脂中，静置0.5 h。加蒸馏水洗至无白色浑浊。加2倍体积的70%的乙醇[11]，洗脱黄酮，得黄色液体。将黄色液体减压浓缩，真空冷冻干燥，称量。

1.3.4单因素试验

1.3.4.1超声时间对毛葱得率的影响

准确称取处理好的毛葱100 g，用80%的乙醇，浸泡20 h，超声功率450 kW，超声温度50℃，超声时间10、20、30、40、50 min。考察超声时间对毛葱黄酮得率的影响。

1.3.4.2超声温度对毛葱得率的影响

准确称取处理好的毛葱100 g，用80%的乙醇，浸泡20 h，超声功率450 kW，超声时间30 min，超声温度40、50、60、70、80℃。考察超声温度对毛葱黄酮得率的影响。

1.3.4.3乙醇浓度对毛葱得率的影响

准确称取处理好的毛葱100g，用55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，浸泡20 h，超声功率450 kW，超声时间30 min，超声温度50℃。考察乙醇浓度对毛葱得率的影响。

1.3.5响应面法优化

用Design-Expert软件，设计三因素三水平的响应面试验，以毛葱总黄酮的得率为试验指标，以超声提取时间，超声温度，乙醇浓度为自变量，选择使用Box-Behnken设计试验，对提取工艺进行优化。试验设计如表1所示。

表1　设计响应面因素及水平Table 1　Design of factors and levels in response surface

1.3.6毛葱黄酮的定性检测

毛葱中纯提取物，经分离纯化，进行如下检测，以确定为黄酮类物质。

1.3.6.1三氯化铝反应

取样品溶液点在滤纸上，滴加1%AlCl3的乙醇溶液，吹干。在可见光下成灰黄色，在紫外光（365 nm）下呈黄色荧光斑点即为黄酮。

1.3.6.2浓氨水反应

取样品溶液点在滤纸上，将滤纸放在浓氨水上30 s，立即在紫外光下观察，若呈极明显的黄褐色荧光斑点，即为毛葱黄酮。

1.3.7毛葱黄酮含量的测定

毛葱黄铜得率计算公式如下：

毛葱黄酮得率/%=m/M×100

式中：m为黄酮质量，mg；M为毛葱总质量，mg。

2　结果与讨论

2.1单因素试验

2.1.1超声时间对黄酮得率的影响

超声时间对毛葱黄酮得率的影响结果如图1所示。

图1　超声时间对毛葱黄酮得率的影响Fig.1　Effect of ultrasonic time on the yield of flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don

由图1可知随着超声时间的增加，黄酮得率增加，当超声时间为20 min时，黄酮得率最大为1.89%。如果再增加超声时间，可能使毛葱的结构遭到破坏，导致提取率下降，因此选20 min作为最佳超声时间。2.1.2

2.1.2超声温度对黄酮得率的影响

超声温度对毛葱黄酮得率的影响结果如图2所示。

图2　超声温度对毛葱黄酮得率的影响Fig.2　Effect of ultrasonic temperature on the yield of flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don

由图2可知，随着超声温度的增加，提取率升高，当超声波温度为60℃时，提取率达到2.01%；但当超声温度继续增加时，破坏黄酮结构，导致提取率逐渐下降，所以选择最佳超声温度为60℃。

2.1.3乙醇浓度对黄酮的率的影响

乙醇浓度对毛葱黄酮得率的影响结果如图3所示。

图3　乙醇浓度对毛葱黄酮得率的影响Fig.3　Effect of ethanol concentration effect on the yield of flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don

黄酮提取率随乙醇浓度的增加而增大，在乙醇浓度为85%时，毛葱黄酮最高得率达到2%，当乙醇浓度大于85%时，提取率趋于稳定，从经济效益考虑，选择85%乙醇进行提取。

2.2响应面优化

根据单因素试验结果，利用响应面法优化毛葱中黄酮的乙醇提取工艺。试验结果如表2、表3所示。

表2　数据分析Table 2　Data analysis

表3　毛葱黄酮得率回归模型方差分析表Table 3　Regression model analysis of variance table for yield of flavonoids

由表3可知，数学模型极其显著，一次项C显著，A、B极为显著，AB、BC显著，AC极显著，二次项A2、B2、C2极为显著，误差项为不显著，说明该模型得到的回归方程与实际情况相差不大，试验误差小，该模型的相关系数为R2=0.991 0＞0.9，表明模型内部试验点相关。通过F值的大小，能得出影响毛葱得率的因素作用显著性大小依次是乙醇浓度＞超声温度＞超声时间。以毛葱黄酮得率为响应值，使用Design-Exper软件，得回归方程：

黄酮提取率=2.00+0.034A-0.038B+8.750E-003C+ 0.013AB+0.020AC+7.500E-003BC-0.086A2-0.099B2-0.047C2

其中A为乙醇浓度，B为超声时间，C为超声温度。式中系数绝对值大小表示对毛葱黄酮得率的影响程度。求得方程得知A=85.12%，B=28.2 min，C=61.11℃，即最佳毛葱黄酮提取工艺为：85.12%乙醇在61.11℃下提取28.2 min，毛葱黄酮提取率达到2.024%。

2.2.1乙醇浓度和超声时间对毛葱黄酮得率影响

乙醇浓度和超声时间对毛葱黄酮得率影响的响应面和等高线结果见图4、图5。

图4　乙醇浓度和超声时间对毛葱黄酮得率影响的响应面Fig.4　Response surface of ethanol concentration and ultrasonic time

图5　乙醇浓度和超声时间对毛葱黄酮得率影响的等高线Fig.5　Contour line of ethanol concentration and ultrasonic time

由图4、图5可知，乙醇浓度和超声时间的曲面较陡，说明这两因素对提取毛葱黄酮的得率均有极显著的影响，呈良好的二次关系。等高线不趋近圆形，说明乙醇浓度与超声时间交互作用时，对黄酮得率有显著的影响。随着乙醇浓度和超声时间的增加，毛葱得率下降。

2.2.2超声温度和乙醇浓度对毛葱得率的影响

超声温度和乙醇浓度对毛葱得率的影响的响应面和等高线结果见下图6、图7。

图6　超声温度和乙醇浓度对毛葱得率的影响的响应面Fig.6　Response surface of ultrasonic temperature and ethanol concentration

图7　超声温度和乙醇浓度对毛葱得率的影响的等高线Fig.7　Contour line of ultrasonic temperature and ethanol concentration

由图6、图7可知，响应面中影响毛葱黄酮得率的因素乙醇浓度和超声温度的曲面较陡，说明单独作用时，这两个因素对提取毛葱黄酮的得率均有极显著的影响，呈良好的二次关系。等高线趋近圆形，说明乙醇浓度与超声温度交互作用时，对黄酮得率没有显著的影响。随着乙醇浓度和超声温度的增加，毛葱黄酮得率下降。

2.2.3超声温度和超声时间对毛葱黄酮得率的影响

超声温度和超声时间对毛葱黄酮得率的影响的响应面和等高线结果见下图8、图9。

由图8、图9可知，响应面中影响毛葱黄酮得率的因素超声温度和超声时间的曲面较陡，说明单独作用时超声温度及超声时间对提取毛葱黄酮的得率均有极显著的影响，呈良好的二次关系。等高线不趋近圆形，说明超声温度与超声时间交互作用时，对黄酮得率有显著的影响。随着乙醇浓度和超声时间的增加，毛葱得率提高。

2.2.4最佳工艺结果

由响应面进一步分析可得，两两因素共同作用对毛葱得率的影响的大小顺序是：乙醇浓度和超声温度＞乙醇浓度和超声时间＞超声时间和超声温度。可以得知最佳工艺条件为：乙醇浓度85.12%，超声时间28.2 min，超声温度61.11℃，黄酮得率为2.024%。

2.3毛葱黄酮的定性分析

提取的毛葱黄酮经Alcl3反应产生少量黄绿色沉淀；与浓氨水反应现象是在紫外灯下呈墨绿色荧光斑点，证明该提取物为黄酮类化合物。

图8　乙醇浓度和超声时间对毛葱黄酮得率影响的响应面Fig.8　Response surface of ethanol concentration and ultrasonic time

图9　乙醇浓度和超声时间对毛葱黄酮得率影响的等高线Fig.9　Contour line of ethanol concentration and ultrasonic time

3　结论

本研究利用超声波辅助法提取毛葱中黄酮化合物，以超声处理时间、超声温度、乙醇浓度进行单因素试验，用大孔吸附树脂对其进行分离纯化，得到黄酮的纯提物。以毛葱黄酮得率为试验指标，确定了最佳工艺条件，然后用响应面试验方法对工艺参数进行优化，从而得出最佳工艺参数。结果表明：最佳工艺条件是：85.12%乙醇在61.11℃下提取28.2 min，毛葱黄酮提取率达到2.024%。

参考文献：

[1]周小平,王广树,杨晓虹,等.分蘖葱头中甾体皂苷成分的分离与鉴定[J].中国药物化学杂志,2004,14(2):102-105

[2]张沐新,王广树,周小平,等.分蘖葱头槲皮素提取工艺的研究[J].特产研究,2009,33(2):31-34

[3]于武.抗癌防衰的副食品——毛葱[J].农民致富之友,2001(5):10

[4]Tram Ngocly,Chiharu Hazama,Makoto Shimoyamada,et al..Antioxidative Compounds from the Outer Scales of Onion[J].J Agric Food Chem,2005,53(21):8183

[5]Freddy A.Ramos,Yoshihisa Takaishi,Miki Shirotori,et al..Antibacterial and Antioxidant Activities of Quercetin Oxidation Products from Yellow Onion(Allium cepa)Skin[J].J Agric Food Chem, 2006,54:3551

[6]Carotenuto Alfonso,Fattorusso Ernesto,Lanzotti Virginia,et al..The flavonoids of Allium neapolitanum[J].Phytochemistry,1997,44(5): 949

[7]Carotenuto Alfonso,Vincenzo DF,Fattorusso Ernesto,et al.The flavonoids of Allium ursinum[J].Phytochemistry,1996,41(2):531

[8]Miyuki Furusawa,Hironori Tsuchiya,Motohiko Nagayama,et al.Anti-Platelet and Membrane Rigidifying Flavonoids in Brownish Scale of Onion[J].J Heath Science,2003,49(6):475

[9]Lytn,Hazama C,Shimoyamada M,et al.Antioxidative compounds from the outer scales of onion[J].J Agric Food Chem,2005,53(21): 8183-8189

[10]李鹏.从分蕖葱头中提取抗氧化活性成分的研究[D].吉林:长春工业大学,2014:

[11]雷红松.大孔吸附树脂分离纯化荷叶黄酮与生物碱研究[D].长沙:湖南农业大学,2008:

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.013

收稿日期：2015-05-28

基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目-毛葱（鬼子葱）的深加工技术及葱油胶囊的研制（吉教科合字[2014]第375号）

作者简介：刘超（1982—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：食品生物技术、生物活性物质研究。

Ultrasonic Assisted Extraction of Flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don

LIU Chao，GAO Jiong-jie
（School of Food Technology，Jilin Agriculture Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China）

Abstract：Ultrasonic assisted extraction of flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don by ethanol was studied in this essay.After macroporous adsorption resin AB-8，the purified flavonoids were identified by AlCl3and ammonia reactions.Three impact factors such as ethanol concentration，ultrasonic time and temperature were determined and optimized by response surface method.And the optimal conditions were as follows：the Allium cepa L.var.Agrogatum Don was extracted by 85.12%ethanol at 61.11℃for 28.2 min，and the yield of flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don was 2.024%.

Key words：Allium cepa L.var.Agrogatum Don；flavonoids；ethanol extraction；response surface