基于向量-子空间夹角判据测定果冻中的色素和防腐剂

刘　柳，粟　晖，姚志湘，*，孙增强，杨德华（.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006；2.广西科技大学广西糖资源绿色加工重点实验室，广西柳州545006）

基于向量-子空间夹角判据测定果冻中的色素和防腐剂

刘柳1，2，粟晖1，2，姚志湘1，2，*，孙增强1，杨德华1
（1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006；2.广西科技大学广西糖资源绿色加工重点实验室，广西柳州545006）

摘要：基于“向量-子空间夹角”判据，建立了果冻中柠檬黄、日落黄和山梨酸钾的同时测定新方法。该方法先进行液相-光谱联用，得到分别扣除果冻中待测组分后的本底光谱数据库。本底库建立后无需再进行仪器联用累积，只需要采集标准品光谱数据和样品光谱数据，即可准确测定样品中待测组分含量，操作快速简便。试验结果表明：该方法计算结果与高效液相色谱法相比，相对误差基本小于±5%，样品加标回收率为95.2%～107.5%，精密度实验相对标准偏差小于2.5%。

关键词：向量-子空间夹角；判据；多波长光纤光谱仪；高效液相色谱；果冻；柠檬黄；日落黄；山梨酸钾

果冻中最为常用的色素包括柠檬黄和日落黄，最常用的防腐剂为山梨酸钾。目前，对这些色素和防腐剂分析检测的主要方法为色谱类方法，包括高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱法、和毛细管电泳法等[1-5]。高效液相色谱法是当前使用最广泛的方法，具有操作简便、灵敏度高等优点，但是分析一个样本的分离时间接近15 min～20 min，大批量样本的分析效率低，操作强度大，分析成本高。此外，陈国庆[6]采用荧光分析对常用合成食品色素进行了定性表征，传娜[7]通过样品处理和仪器改造消除了测量中的物理、化学干扰，对食品中的山梨酸钾进行了光谱定量分析。姚志湘等提出采用“向量-子空间夹角”[8-11]作为判据，用于判断组分在体系中是否存在，并将角度量度代替强度量度进行准确定量。果冻本底光谱库和标准光谱库建立后，只需要采集样品光谱，无需液相分离，即可同时测定果冻中的柠檬黄、日落黄和山梨酸钾含量，分析速度快，测定效果理想。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器

Maya2000紫外-可见光纤光谱仪（扫描波长范围：190 nm～1 100 nm）：美国海洋光学公司；AL104电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪：日本岛津科公司；柠檬黄（AR），日落黄（AR），山梨酸钾（AR），乙酸铵（AR）；乙腈（GR）；二次蒸馏水。

1.2方法

1.2.1标准光谱数据库的建立

分别精确称取0.149 5 g柠檬黄，0.150 3 g日落黄，0.125 0 g山梨酸钾标准品于小烧杯中，用二次蒸馏水溶解，分别转移定容至100、100 mL和250 mL容量瓶中，得到1 495 μg/mL柠檬黄标准储备液，1 503 μg/mL日落黄标准储备液，500 μg/mL山梨酸钾标准储备液。根据多波长紫外可见光谱仪的响应范围，用二次蒸馏水依次稀释标准母液，得到一系列不同浓度的标准溶液，再分别采集一系列不同浓度的柠檬黄标准溶液，日落黄标准溶液，山梨酸钾标准溶液的190 nm～1 100 nm紫外可见光谱数据，经最小二乘回归得到标准光谱数据库v柠檬黄，v日落黄，v山梨酸钾。

1.2.2市售果冻样本光谱数据库的建立

果冻样品的处理：称取一定量果冻，在匀浆机中均质，称取均质后的果冻30 g，加入15 mL 20%的乙醇水溶液混匀，倒入一次性塑料杯中，置于-20℃～-30℃冰箱中冷冻2 h，冷冻处理后色素和防腐剂与果冻中的凝胶多糖类物质快速分离。取冷冻后的果冻冰渣快速抽滤，用约10 mL蒸馏水分3次淋洗，合并滤液转移至25 mL容量瓶中，定容，得到待测的果冻样品，分别采集190 nm～1 100 nm的果冻样品的光谱数据a1～a5。

1.2.3本底光谱数据库的建立

确定被测组分与本底组分完全分离的高效液相色谱条件，将液相与光谱联用，采集市售果冻样本经过色谱柱完全分离后的光谱数据。从光谱数据中分别扣除果冻样品中的待测组分柠檬黄、日落黄和山梨酸钾光谱数据，分别得到不含待测组分的本底光谱数据库N柠檬黄，N日落黄，N山梨酸钾。

1.2.4高效液相色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；柱温：30℃；可见紫外光纤光谱仪扫描波长：190 nm～1 100 nm；流动相：0.01 min～9.00 min，乙腈∶0.04 mol/L乙酸铵水溶液=10∶90（体积比）；9.01 min～20.00 min，乙腈∶0.04 mol/L乙酸铵水溶液=40∶60（体积比）；20.01 min～35.00 min，乙腈∶水=10∶90（体积比）；35.01 min～60.00 min，乙腈∶水=95∶5（体积比）。

1.2.5市售果冻中柠檬黄、日落黄和山梨酸钾含量的测定

将1#～5#果冻经样品处理方法采集紫外-可见光谱数据，导入Matlab计算平台，选取200 nm～600 nm波段，应用空间夹角判据算法分别计算色素和防腐剂的含量。

1.2.6加标回收率试验

在已知浓度的3份果冻样品中分别添加一定量的柠檬黄、日落黄和山梨酸钾标准品，测定加标回收率。

2　结果与分析

2.1标准光谱库的建立

分别配制一系列浓度为2 μg/mL～30 μg/mL的柠檬黄标准溶液、3 μg/mL～30 μg/mL的日落黄标准溶液以及浓度为2 μg/mL～10μ g/mL的山梨酸钾标准溶液，以水为空白，分别采集不同浓度标准溶液的190 nm～1 100 nm波长范围光谱，记入标准光谱数据库,如图1～图3所示。

图1　不同浓度柠檬黄标准溶液光谱图Fig.1　Multi-wavelength spectral libraries of tartrazine in different concentration

3种待测组分的线性方程、相关系数及线性范围见表1所示。

选择200 nm～600 nm波长范围光谱，根据函数yi= aix+bi，分别对3种标准物质进行多变量最小二乘回归后得到标准光谱数据库，记为v柠檬黄，v日落黄，v山梨酸钾。

2.2建立市售果冻的光谱数据库

在全波长下测定果冻样品的紫外吸光度值，构成果冻样本光谱库，图4为果冻样品的紫外可见光谱图。

图2　不同浓度日落黄标准溶液光谱图Fig.2　Multi-wavelength UV spectral libraries of sunset yellow in different concentration

图3　不同浓度山梨酸钾标准溶液光谱图Fig.3　Multi-wavelength UV spectral libraries of potassium in different concentration

表1　柠檬黄等3种物质的线性回归方程Table 1　Linear regression equations，correlations，ranges of the three standard components

图4　市售果冻样品光谱图Fig.4　Multi-wavelength UV spectral libraries of jelly samples from the market

2.3本底光谱数据库的建立

2.3.1建立不含待测组分的光谱数据库

在待测组分与本底组分完全分离的高效液相色谱条件下，得到待测样本和对照品样本的高效液相色谱图。图5为待测组分对照品在254 nm处的高效液相色谱图，两种色素的出峰时间分别为柠檬黄4.678 min、日落黄16.299 min，防腐剂山梨酸钾6.799 min；图6为果冻样本在254 nm处的高效液相色谱图。

图5　标准混合溶液的高效液相色谱图Fig.5　HPLC chromatograms of the mixed standard solutions

图6　果冻样品的高效液相色谱图Fig.6　HPLC chromatograms of jelly sample

经分析对比，图6中其他的色谱峰为果冻样本中相对于色素或防腐剂的本底物质。以待测组分柠檬黄为例，从果冻样本的色谱图中扣除与柠檬黄具有相同保留时间的光谱数据，其余数据为测定柠檬黄含量的本底数据；合并多个果冻样本的本底光谱数据库构成测定柠檬黄含量的本底光谱数据库N柠檬黄。测定日落黄和山梨酸钾的本底光谱库则分别扣除日落黄纯光谱以及山梨酸钾纯光谱后得到N日落黄，N山梨酸钾。

2.3.2本底光谱数据库的降维

液相-光谱联用获取的本底光谱数据库N数据量巨大，直接采用N作为本地数据库，运算时间长，影响了方法的时效性。以柠檬黄为例，在Matlab计算平台，选用主成分分析[12]，在标准化的果冻样本光谱中添加一定强度的白噪声掩蔽不均匀噪声和非线性因素的干扰，以二阶差分值序列的折点判断独立变量数目，得到体系主成分数目q，所得主成分数目与二阶差分值变化如图7所示。

经图7可判断测定柠檬黄的本底主成份数为17，应用[U，S，V]=svd（N）对本底光谱数据库N进行奇异值分解降维，分解后得到m阶行正交矩阵U、n阶列正交矩阵V和奇异值矩阵S，取U的前17列，为降维后的本底数据库N柠檬黄，同理得到N日落黄和N山梨酸钾。

图7　二阶差分序列变化图Fig.7 Change of second difference successive value

2.3.3果冻中柠檬黄、日落黄和山梨酸钾含量的测定

将所述本底光谱数据库N、标准光谱数据库v以及果冻样本光谱数据a导入Matlab计算平台，应用向量-子空间夹角判据算法计算一定质量的1#-5#果冻样本中待测组分的实际含量。再由于某些果冻中的山梨酸钾含量高于线性范围，故根据样品光谱吸光度值，将果冻提取液稀释25倍后再测定山梨酸钾含量。采用高效液相色谱法测定结果进行对比，对比结果见表2所示。

表2　两种方法测定果冻样本中柠檬黄、日落黄和山梨酸钾的含量Table 2　Determinations of tartrazine，sunset yellow and potassium sorbate in jelly by HPLC and vector-subspace angle criterion

由表2可知，采用向量-子空间夹角判据测定计算果冻中的柠檬黄、日落黄和山梨酸钾含量，与高效液相色谱测定结果对比，相对误差小于±6%，说明向量-子空间夹角判据方法测定结果准确。

2.3.4精密度试验结果

对2#样品连续采集5次多波长光谱数据，按向量-子空间夹角判据进行计算，5次测定样品含量的平均值（C5）和相对标准偏差（RSD）如表3所示。

表3　2#样品的相对标准偏差（n=5）Table 3　Relative standard deviation of the 2#sample（n=5）

结果表明，相对标准偏差RSD小于2.5%，方法精密度好。

2.3.5回收率实验结果

在已知浓度的3份果冻样品中分别添加一定量的柠檬黄、日落黄和山梨酸钾标准品，测定加标回收率，采用向量-子空间夹角判据进行计算，3种待测组分的样品加标回收率在95.2%～107.5%之间，相对标准偏差RSD如表4所示。

表4　加标回收率实验结果Table 4　Results of the recovery tests（n=9）

结果表明，方法的准确度较好，可适用于市售果冻中色素和防腐剂的快速同时测定。

3　结论

通过液相-紫外可见光谱联用，一次建库，可解决成分复杂的分析体系自配本底组分建库不全的缺陷。对于同类样品的测定，进行一次色谱分离后，无需再利用联用仪器累积本底，仅通过光谱测量即可实现同类果冻中柠檬黄、日落黄和山梨酸钾含量的同时测定，可降低机时和试剂损耗。其结果和高效液相色谱法计算结果相近，相对误差基本小于±5.0%，样品加标回收率为95.2%～107.5%，方法准确性和精密度较好，适用于市售果冻中色素和防腐剂的批量定量分析。

参考文献：

[1]刘英,尹州,邹晓筱,等.高效液相色谱法同时测定蜜饯中的16种食品添加剂[J].分析测试学报,2011,30(6):651-655

[2]DE ANDRADEA F L,GUEDESB M L F,VIEIRAC I G P,et al.Determination of synthetic food dyes in commercial soft drinks by TLC and ion-pair HPLC[J].Food Chemistry,2014,157(15):193-198

[3]PEREZ-URQUIZA M,BELTRAN J L.Determination of dyes in foodstuffsby capillary zone electrophoresis[J].Journal of Chromatography A,2000,898(2):271-275

[4]夏立娅,韩媛媛,匡林鹤,等.薄层色谱扫描法同时检测豆制品中碱性橙、皂黄、柠檬黄和日落黄以及辣椒粉中酸性橙Ⅱ、丽春红2R和罗丹明B[J].分析实验室,2010(29)6:15-18

[5]BONAN S,FEDRIZZI G,MENOTTA S,et al.Simultaneous determination of synthetic dyes in foodstuffs and beverages by high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector [J].Dyes and Pigments,2013,99(1):36-40

[6] 陈国庆,吴亚敏,王俊,等.常用合成食品色素荧光光谱研究[J].光谱学与光谱分析,2009,29(9):2518-2522

[7]传娜,徐溢,陈刚,等.微型光谱分析系统检测食品添加剂山梨酸的研究[J].光谱学与光谱分析,2012,32(8):2299-2302

[8]姚志湘,粟晖.基于子空间重合判断的混合光谱模式识别方法:中国,201110188411,4[P].2011-07-06

[9]方凤,粟晖,姚志湘,等.采用向量扣减方法分析化妆品中对羟基苯甲酸酯[J].分析测试学报,2013,32(6):732-736

[10]粟晖,方凤,姚志湘,等.基于HPLC-UV与空间夹角判据的化妆品中对羟基苯甲酸酯分析[J].计算机与应用化学,2014,31(5):611-614

[11]陈成,粟晖,姚志湘,等.采用向量-子空间夹角判据测定酱油中的苯甲酸和山梨酸[J].中国食品添加剂,2013(5):223-227

[12]QIA X,LUO R Y,ZHAO H Y.Sparse principal component analysis by choice of norm[J].Journal of Multivariate Analysis,2013,114 (1):127-160

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.034

收稿日期：2014-11-27

基金项目：广西自然科学基金（2014GXNSFAA118056）；广西科技大学科学基金（校科自1307104）；广西大学生创新创业训练计划资助项目

作者简介：刘柳（1979—），女（汉），高级实验师，硕士，研究方向：过程分析技术。

*通信作者：姚志湘（1968—），男（汉），教授，博士，研究方向：过程分析技术。

Determination of Pigment and Preservative in Jelly Based on Vector-subspace Angle Criterion

LIU Liu1，2，SU Hui1，2，YAO Zhi-xiang1，2，*，SUN Zeng-qiang1，YANG De-hua1
（1.Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，Guangxi，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，Guangxi，China）

Abstract：A new direct determination of tartrazine，sunset yellow and potassium sorbate in jelly were estabilished which was based on vector-subspace angle criterion.With HPLC-Spectrometer，the multiwavelength spectral databases of the samples background were constructed.In the samples background，the tartrazine，sunset yellow and potassium sorbate had been deducted respectively from jelly samples.The spectral databases of the samples background should not be repeated by HPLC-Spectrometer once it had been constructed.Then the multi-wavelength UV spectral databases of jelly samples and the standardants were constructed by multi-wavelength spectrometer.In the study，three kinds of spectral databases were established to calculate the content of synthetical pigments and preservative in jelly quickly and simply based on Vectorsubspace angle criterion.The results showed as following：The relative error of the results of Vector-space angle criterion was less than 5.0%compared with the results of high performance liquid chromatography.The recoveries of tartrazine，sunset yellow and potassium sorbate were 95.2%-107.5%and the relative standard deviation（n=5）of precision tests were less than 2.5%.

Key words：vector-subspace angle；criterion；multi-wavelength spectral；HPLC；jelly；tartrazine；sunset yellow；potassium sorbate