产酸性蛋白酶菌株的诱变育种研究

曲　波（吉林工程职业学院，吉林四平136001）

产酸性蛋白酶菌株的诱变育种研究

曲波
（吉林工程职业学院，吉林四平136001）

摘要：从玉米浸泡液中筛选产酸性蛋白酶的菌株，命名Y-5.0，通过对选育获得的Y-5.0进行紫外-亚硝基胍交替诱变研究发现：紫外诱变最佳菌体稀释度为10-5、最佳照射时间为20 s；NTG诱变最佳浓度为500 μg/mL、最佳诱变稀释度为10-4、最佳诱变作用时间为50 min。通过三轮紫外和亚硝基胍（NTG）交替诱变筛选获得高产蛋白酶的菌株N3-15，其产蛋白酶的活力最高为12 152 nKat/mL，其大大高于原始菌株Y-5.0的酶活，而且该菌株N3-15传代5次产量稳定。

关键词：蛋白酶；菌株；诱变

从自然界经稀释涂布分离得到的菌种，由于其生产能力较低，一般不能满足工业化大规模的生产。因此，采用物理或化学诱变方法选育高产的诱变菌株，弥补生产能力低的不足，这已成为一种常规的选育菌种技术[1]。其中紫外线是最常用的一种物理诱变方法，它直接作用于DNA，使其相邻的胸腺嘧啶转变成二聚体，其优点是危险性小、诱变效果较好。常用的化学诱变剂主要采用烷化剂中的亚硝基化合物，它的主要作用是引起DNA链中GC和AT的转换，享有超诱变剂之称[2]。

本试验以玉米浸泡液中筛选获得一株产蛋白酶的菌株Y-5.0为出发菌株，经过紫外-化学三轮交替诱变处理，筛选出一株高产蛋白酶的突变株，为进一步提高蛋白酶的活力奠定良好基础[3]。

1　材料、仪器及设备

1.1菌种

Y-5.0：中粮生化能源有限公司（公主岭市）生产车间的玉米浸泡液中筛选获得。

1.2试剂

亚硝基胍（NTG）、酵母膏、琼脂、葡萄糖、酪蛋白、蛋白胨、（NH4）2SO4、CaCl2、FeSO4·7H2O、KH2PO4、MgSO4· 7H2O、NaCI、磷酸缓冲溶液[4]。

1.3培养基

YEPD培养基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，蛋白胨2 g，琼脂1.5 g～2.0 g，pH 6.5。

分离培养基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，1%酪蛋白，蛋白胨2 g，琼脂1.5 g～2.0 g，pH 6.5。

淀粉培养基：蛋白胨1 g，牛肉膏0.5 g，可溶性淀粉0.2 g，NaCl 0.5 g，琼脂1.5 g～2.0 g，pH 6.5。

种子培养基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，蛋白胨2 g，pH 6.5。

发酵培养基：葡萄糖2 g，酵母膏1 g，（NH4）2SO40.2 g，CaCI20.02 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，pH 6.5，接种量5%[5]。

1.4仪器与设备

本试验所用到的仪器与设备详见表1。

表1　仪器设备Table 1　Instruments and equipments

2　方法

2.1紫外诱变最佳浓度梯度的确定

取对数生长期的菌体制成菌悬液，吸取1 mL用无菌生理盐水依次梯度稀释至10-6浓度，分别吸取各稀释度的菌悬液100 μL均匀涂布于YEPD培养基凝固平板中[6]。将涂布平板与紫外灯下照射20 s，避光保存在30℃培养箱中48 h，查数诱变后的菌落个数，确定最佳稀释梯度[7]。

试验均以未经过紫外线照射的YEPD培养基平板为对照。

2.2紫外诱变最佳照射时间的确定

取100 μL稀释度为10-5的菌悬液均匀地涂布到YEPD固体培养基平板中，分别在紫外线灯下照射10、20、30 s。避光保存在30℃培养箱中48 h，查数诱变后的菌落个数，确定最佳紫外照射时间[8]。

试验均以未经过紫外线照射培养的YEPD培养基平板为对照。

2.3NTG最佳浓度的确定

分别配制浓度为100、300、500μg/mL和700μg/mL 的NTG溶液。取对数生长期的菌悬液离心-磷酸缓冲液洗涤-NTG诱变40 min-离心-磷酸缓冲液洗涤-取各稀释浓度的菌悬液100 μL均匀涂布于YEPD固体培养基平板中，30℃培养箱中培养48 h，查数诱变后的菌落个数，确定最佳NTG浓度[9]。

2.4NTG诱变最佳作用时间的确定

将对数生长期的菌株制成菌悬液离心-磷酸缓冲液洗涤-NTG作用不同时间（20、30、40、50、60、70 min）-离心-磷酸缓冲液洗涤-取各稀释浓度的菌悬液100 μL均匀涂布于YEPD固体培养基平板中，30℃培养箱中培养48 h，查数诱变后的菌落个数，确定最佳NTG诱变时间[10]。

2.5NTG诱变最佳稀释梯度的确定

取对数生长期菌悬液-离心-磷酸缓冲液洗涤-NTG诱变40 min-离心-磷酸缓冲液洗涤-依次稀释梯度至10-5，分别取不同稀释度菌悬液100 μL涂布于YEPD固体培养基中，30℃培养箱中培养48 h，查数诱变后的菌落个数，确定最佳NTG菌体浓度[11]。

2.6紫外和亚硝基胍（NTG）交替诱变育种

取100 μL稀释度为10-4的对数期菌悬液均匀涂布于YEPD固体培养基平板中，在紫外线灯下照射20s，避光保存在30℃培养箱中48 h。挑选诱变后长势良好的菌株反复筛选发酵，测定发酵液的蛋白酶活力[12]。将蛋白酶活力高的菌株传代4次并发酵测蛋白酶活力。

将紫外诱变后产量稳定的的高产菌株经NTG诱变40 min，均匀涂布于YEPD培养基中，30℃培养箱中培养48 h，挑选诱变后长势良好的菌株反复筛选发酵，测定发酵液的蛋白酶活力。将蛋白酶活力高的菌株传代5次并发酵测蛋白酶活力。

挑取上述诱变后蛋白酶活力含量较高的高产菌株进行紫外诱变，筛选诱变后的高产菌株发酵测其蛋白酶活力。反复如上，经过三轮紫外和亚硝基胍（NTG）交替诱变，选育高产酸性蛋白酶菌株[13]。挑选诱变后长势良好的菌株反复筛选发酵，测定发酵液的蛋白酶活力。将蛋白酶活力高的菌株传代5次并发酵测蛋白酶活力。

试验均做3个平行样。

3　结果与分析

3.1紫外诱变最佳浓度梯度的选择

紫外诱变最佳浓度梯度的选择试验结果见表2。

表2　紫外诱变最佳浓度的选择Table 2　The choice of the best concentration of UV mutagenesis

由于菌体的致死率在70%～80%之间，菌体发生正突变的机率较大。从表2中可看出，当稀释度为10-4时，菌株的致死率为75.5%，随着稀释梯度的减小，菌株的致死率在不断地增大；因为工作量的原因选择稀释度10-5，故在以后的试验中采用10-5为最佳稀释度。

3.2紫外诱变最佳时间的确定

紫外诱变最佳时间的确定试验结果见表3。

表3　紫外诱变最佳时间的确定Table 3　UV mutagenesis to determine the best time

由表3紫外诱变的最佳时间结果显示：随着紫外照射时间的延长，菌株的致死率在不断地增大。当紫外照射的诱变时间为20 s时，诱变菌株的致死率在78.18%，因此确定最佳诱变时间为20 s。

3.3NTG最佳浓度的确定

NTG最佳浓度的确定试验结果见表4。

表4　NTG最佳浓度的确定Table 4　Determine the optimal concentration of NTG

由表4可以看出最佳NTG浓度为500 μg/mL。表4显示随着NTG浓度的不断增大加，菌株的致死率也在不断地增加，其在500 μg/mL时满足致死率在70%～80%的范围，其向正突变的几率较大。

3.4NTG最佳作用时间的确定

NTG最佳作用时间的确定试验结果见表5。

表5　NTG最佳作用时间的确定Table 5　Best time to determine the role of NTG

从表5可以看出NTG最佳作用时间为50 min。表5显示随着NTG作用时间的延长，致死率在不断地增大，其在50 min时满足致死率在70%～80%的范围，其向正突变的几率较大，故确定今后试验NTG诱变时间为50 min。

3.5NTG最佳稀释度的确定

NTG最佳稀释度的确定试验结果见表6。

表6　NTG最佳稀释度的确定Table 6　Determination of the optimal dilution of NTG

从表6可以看出，从稀释度10-3递增至10-6，致死率在不断地减少；当稀释度为10-4时满足最佳致死率范围，致死率为70.32%，因此选择10-4时为最佳NTG稀释度。

3.6三轮紫外-化学复合诱变

采用Folin-酚法测定光密度OD680nm值，计算蛋白酶酶活力。

表7为第一轮紫外诱变后菌株发酵产蛋白酶的酶活力。

表7　第一轮紫外诱变后菌株发酵产蛋白酶的活力Table 7　After the first round of UV mutagenesis producing protease fermentation

从表7可以看出，突变株UV1-8产蛋白酶的活力最高，达到2 476 nKat/mL。以突变株UV1-8为出发菌株进行以下试验的NTG诱变。表8为第一轮NTG诱变后菌株发酵产蛋白酶的酶活力。

表8　第一轮NTG诱变后菌株发酵产蛋白酶的活力Table 8　NTG mutant strain after the first round of protease fermentation

从表8可以看出，蛋白酶活力最高的菌株为N1-Ⅴ突变株，蛋白酶活力达到5 226 nKat/mL。

表9为第二轮紫外诱变后筛选出产蛋白酶活力较高的菌株。

表9　第二轮紫外诱变后菌株发酵产蛋白酶的活力Table 9　After the second round of UV mutagenesis producing protease

从表9可以看出，突变株UV2-18的蛋白酶活力最高为7 827 nKat/mL。表10为第二轮NTG诱变后菌株发酵产蛋白酶菌株。

表1　0 第二轮NTG诱变后菌株发酵产蛋白酶的活力Table 10　NTG mutant strain after the second round of protease fermentation

从表10可以看出，突变株N2-Ⅲ蛋白酶活力最高为9 144 nKat/mL。

表11为第三轮紫外诱变后筛选获得的产蛋白酶活力较高的菌株。

表1　1　第三轮紫外诱变后菌株发酵产蛋白酶活力Table 11　After the third round of UV mutagenesis protease fermentation products

从表11可以看出，UV3-34突变株蛋白酶活力为10 569 nKat/mL。表12为第三轮NTG诱变后筛选获得的产蛋白酶活力较高的菌株。

表1　2 第三轮NTG诱变后菌株发酵产蛋白酶活力Table 12　NTG mutant strain after the third round of protease fermentation products

从表12可以看出，其中N3-15突变株的蛋白酶活力最高，其蛋白酶活力为12 152 nKat/mL。

将紫外-NTG交替诱变后产蛋白酶活力最高的N3-15突变株连续传代5次，发酵测定其蛋白酶活力如表13所示。

表1　3第三轮NTG诱变后N3-15菌株5次传代发酵产蛋白酶活力Table 13　The third round of NTG mutagenesis N3-15 strain of 5 passages fermentation of protease activity

从表13可以看出该突变株产蛋白酶活力稳定，其蛋白酶酶活力为12 152 nKat/mL。

4　结论

通过对选育获得的Y-5.0进行紫外-亚硝基胍交替诱变研究发现：紫外诱变最佳菌体稀释度为10-5、最佳照射时间为20 s；NTG诱变最佳浓度为500 μg/mL、最佳诱变稀释度为10-4、最佳诱变作用时间为50 min。通过三轮紫外和亚硝基胍（NTG）交替诱变筛选获得高产蛋白酶的菌株N3-15，其产蛋白酶的活力最高为12 152 nKat/mL，其大大高于原始菌株Y-5.0的酶活，而且该菌株N3-15传代5次产量稳定。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.045

收稿日期：2015-03-24

作者简介：曲波（1982—），男（汉），讲师，研究生，研究方向：食品发酵，食品营养。

Research on the Mutation Breeding of Acid Protease-producing Strains

QU Bo
（Jilin Engineering Vocational College，Siping 136001，Jilin，China）

Abstract：Screening the high-yield strains of acid protease from the corn immersion.The high-yield strains of acid protease was named Y-5.0.Mutagenesis studies of Y-5.0 showed that the best conditions of UV mutagenesis：the dilution of bacteria was 10-5，the best exposure time of UV mutagenesis was 20 s，NTG mutagenesis best conditions：NTG concentration was 500 ug/mL，NTG mutagenesis dilution was 10-4，the best action time of NTG mutagenesis was 50 min.By three times of UV and nitrosoguanidine（NTG）mutation alternately breeding screening，we obtained the highest protease activity mutant named N3-15，the activity of Its producing protease reached 12 152 nKat/mL，far exceeding the activity of the original strain Y-5.0.This strain passed five times and performed a good genetic stability.

Key words：protease；strain；mutagenesis