应用多功能荧光酶标仪分析盐酸阿霉素含药量

侯玉群，胡姗姗，宋长伟，董 伟，惠 景，朱欣婷，范 芳，刘 云

（遵义医学院，贵州遵义563000）

应用多功能荧光酶标仪分析盐酸阿霉素含药量

侯玉群，胡姗姗，宋长伟，董 伟，惠 景，朱欣婷，范 芳，刘 云

（遵义医学院，贵州遵义563000）

目的 建立应用多功能荧光酶标仪对盐酸阿霉素（多柔比星）含药量直接进行荧光分析的方法。方法在体系为0.050 mol/L氨丁三醇（pH 6.30）条件下设定激发波长和发射波长分别为495、595 nm，应用多功能酶标仪测定盐酸阿霉素荧光值。结果 盐酸阿霉素为0.78～25.00 μM时荧光强度呈良好线性（R2=0.979），加样回收率达97.97%以上。该法用于测定SD大鼠血样中盐酸阿霉素时回收率为98.30%～98.80%。结论 该法具有较好的准确度与灵敏度，适用于盐酸阿霉素含药量测定及在血样中的分析测定。

多柔比星/血液； 氨丁三醇； 大鼠，Sprague-Dawley； 血清； 多功能荧光酶标仪

盐酸阿霉素（doxorubicin hydrochloride）又称为盐酸多柔比星，是一种在临床上被广泛应用的蒽环类抗癌类药物，抗癌谱广，可用于治疗肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等[1-2]。因其具有较强的心脏毒性、骨髓抑制及消化道不良反应，常需监测其在体内的药物浓度，以调整化疗方案从而达到理想的疗效。目前，对盐酸阿霉素的检测方法有紫外检测法、高效液相色谱法和荧光检测法；其中普通的荧光分光光度法具有灵敏度高、检测限低等优点；但样品的检测通量很低，只能对单一样品逐个进行检测，并且检测所需样本量也较大，给前期收集处理样本带来了麻烦[3-7]。因此，本研究尝试采用多功能荧光酶标仪同时实现对多个微量样品的连续检测，以提高检测效率，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 盐酸阿霉素（美国Sigma公司）、注射用盐酸（深圳万乐药业有限公司）、VARIOSKAN FLASH多功能酶标仪（美国Thermo公司）、pHS-2C型精密酸度计（上海精密科学仪器有限公司）、精密电子天平（德国Sartorious公司）等。SD大鼠（雄性，体质量 250 g，清洁级）由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供（许可证号：SCXK渝2007-0005）。

1.2 方法

1.2.1 配制标准溶液 称取58 mg盐酸阿霉素用氨丁三醇（pH 6.30）[8]溶解后定容于100.0 mL容量瓶中，得到1.00 mM的贮备液，放置于4℃下保存。每次实验准确移取适量储备液，配制所需的阿霉素标准溶液。

1.2.2 确定激发波长和发射波长

1.2.2.1 固定发射波长 在400～600 nm波长范围扫描发射光谱，确定盐酸阿霉素所合适检测的发射波长。

1.2.2.2 固定激发波长 在520～700 nm范围内扫描发射光谱，确定盐酸阿霉素所合适检测的激发波长。

1.2.3 绘制标准曲线 采用二倍稀释法配制25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 μM盐酸阿霉素溶液，各取200.0 μL加入96孔板黑色酶标板，用多功能荧光酶标仪测定其荧光强度。设定激发波长为495 nm、发射波长为595 nm检测荧光强度，

1.2.4 检测注射用盐酸阿霉素 称取注射用盐酸阿霉素1.5、2.0、3.0 mg用氨丁三醇（pH 6.30）溶解后定容于50.0 mL容量瓶中。采用多功能荧光酶标仪直接测定各样品荧光值，平行检测5孔，由标准曲线计算其含药量。

1.2.5 加样回收实验 准确称取注射用盐酸阿霉素6.5 mg，用氨丁三醇（pH 6.30）溶解后定容于100.0 mL容量瓶中。分别量取10.0 mL盐酸阿霉素注射剂溶液，置于3个50.0 mL容量瓶中，分别加入1.00 mM盐酸阿霉素溶液2.0、4.0、6.0 mL，用氨丁三醇（pH 6.30）定容，检测荧光强度，平行检测3次，取平均值，然后计算回收率。

1.2.6 SD大鼠血样中盐酸阿霉素加样回收实验 将1.2 mL SD大鼠血清移入 5.0 mL离心管中分别加入0.10、0.15、0.20 mM盐酸阿霉素标准液2.0 mL，再分别加入1.2 mL乙腈，于高速离心机中离心沉淀除去蛋白。取离心后上清液，再加入氨丁三醇（pH 6.30）定容于25.0mL容量瓶中进行回收率测定试验[7]。

2 结 果

2.1 激发波长和发射波长 在495 nm附近出现明显吸收峰，固定激发波长为495 nm；在595 nm处出现明显发射峰。盐酸阿霉素的激发波长和发射波长分别为495、595 nm。

2.2 标准曲线 盐酸阿霉素为0.78～25.00 μM时具有较好线性关系，线性方程为Y=1.835X+7.44，R2=0.979；式中：Y为荧光强度，X为盐酸阿霉素含药量。

2.3 盐酸阿霉素注射剂中盐酸阿霉素的含药量 盐酸阿霉素注射剂含药量为12.00%，且不同样品量检测出的盐酸阿霉素含药量基本一致，见表1。

表1 盐酸阿霉素注射剂含药量

2.4 盐酸阿霉素注射剂加样回收率 注射用盐酸阿霉素含药量加样回收率均在97.97%以上，见表2。

2.5 SD大鼠血清中盐酸阿霉素加样回收率 SD大鼠血清中盐酸阿霉素加样回收率均在98.00%以上，见表3。

表2 盐酸阿霉素注射剂加样回收率

表3 SD大鼠血清中盐酸阿霉素加样回收率

3 讨 论

本研究建立了一种多功能荧光酶标仪快速定量检测盐酸阿霉素的方法。该方法的特点是利用氨丁三醇（pH 6.30）稳定检测体系，盐酸阿霉素的线性检测范围为0.78～25.00 μM；且能对SD大鼠血清中含有的盐酸阿霉素进行有效检测。多功能荧光酶标仪所需血样量只有荧光分光光度计的1/10且可同时检测多个样本，适用于临床样本的快速检测。

[1]Liu X，Chen Z，Chua CC，et al.Melatonin as an effective protector against doxorubicin-induced cardiotoxicity[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283（1）：H254-263.

[2]国家医药管理局医药工业情报中心站.新药指南[M].北京：中国医药科技出版社，1989：458-459.

[3]江崇球，高明霞.盐酸表阿霉素与牛血清白蛋白相互作用的研究及药物在血清与尿样中含量的测定[J].光谱学与光谱分析，2003，23（5）：937-940.

[4]Gilbert CM，Filippich LJ，McGeary RP，et al.Pharmacokinetics of doxorubicinol in dogs[J].J Vet Pharmacol Ther，2006，29（5）：433-435.

[5]Lewis AL，Taylor RR，Hall B，et al.Pharmacokinetic and safety study of doxorubicin-eluting beads in a porcine model of hepatic arterial embolization[J].J Vasc Interv Radiol，2006，17（8）：1335-1343.

[6]赵刚，胡增华，黄力明，等.荧光光谱法测定人血浆中国产阿霉素浓度及临床药代动力学观察[J].云南医药，1994，15（5）：377-379.

[7]Piall E，Aherne GW，Marks V.Evaluation of a commercially available radioimmunoassay kit for measurement of doxorubicin in plasma[J].Clin Chem，1982，28（1）：119-121.

[8]李桂云.荧光分析法测定注射用盐酸阿霉素的含量[J].中国药物与临床，2013，13增刊：26-27.

Application of multifunctional fluorescent enzyme-labeled instrument in analyzing doxorubicin hydrochloride content

Hou Yuqun，Hu Shanshan，Song Changwei，Dong Wei，Hui Jing，Zhu Xinting，Fan Fang，Liu Yun
（Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563000，China）

ObjectiveTo establish a direct fluorometric analytical method by using the multifunctional fluorescent enzyme-labeled instrument for detecting the doxorubicin hydrochloride content.MethodsUnder the condition of the system as 0.050 mol/L tromethamine，the excitation wavelength and emission wavelength were set as 495 nm and 595 nm，the multifunctional fluorescent enzyme-labeled instrument was used to detect the fluorometric value of doxorubicin hydrochloride.ResultsThe fluorescence intensity of doxorubicin hydrochloride had a good linearity when doxorubicin was 0.78-25.00 μM（r2=0.979），the recovery rate was above 97.97%.The recovery rate was 98.30%-98.80%when detecting the recovery rate of doxorubicin in SD rat blood sample.ConclusionThe established method has better accuracy and sensitivity，and is suitable for the determination of doxorubicin hydrochloride content and the analytic determination of blood sample.

Doxorubicin/blood； Tromethamine； Rats，Sprague-Dawley； Serum； Multifunctional fluorescent enzyme-labeled instrument

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.24.002

A

1009-5519（2015）24-3692-02

2015-09-02）

贵州省科技厅社会发展攻关项目（黔科合SY[2013]3008）；贵州省教育厅特色重点实验室建设项目（黔教合KY字[2014]212）；遵义医学院招标项目（F-614）。

侯玉群（1989-），男，山东菏泽人，在读硕士研究生，主要从事抗癌药物载体开发的研究；E-mail：zz10001@qq.com。

刘云（E-mail：liuyunzy@126.com）。