细胞团块收集器联合免疫标记在良、恶性胸水中的应用研究*

韩军平，王丽曾，罗文潇，马文霞，达春和

（甘肃省白银市第一人民医院1.病理科，2.呼吸科，甘肃白银730900）

·临床论著·

细胞团块收集器联合免疫标记在良、恶性胸水中的应用研究*

韩军平1，王丽曾1，罗文潇1，马文霞1，达春和2

（甘肃省白银市第一人民医院1.病理科，2.呼吸科，甘肃白银730900）

目的探讨细胞团块收集器联合免疫标记在良、恶性胸水中的应用。方法采用细胞团块收集器收集胸水，将临床送检的115例胸水制作细胞切片，苏木精-伊红染色法（HE）、免疫组织化学法染色，行细胞形态学观察及鉴别诊断，并与2009～2013年送检的胸水标本经传统细胞涂片或液基薄层技术细胞诊断结果进行比较研究。结果115例胸水中，经免疫及形态学证实为恶性胸水18例，恶性细胞检出率为16％，传统细胞涂片胸水癌细胞检测阳性率为5％，差异有统计学意义（P＜0.05）。在异型性细胞中，Ki-67、癌胚抗原（CEA）、甲状腺转录因子-1（TTF-1）、Napsin-A、细胞角蛋白7（CK7）在肺腺癌细胞中表达较好；而Calretinin、间皮细胞（MC）、Wilms肿瘤基因（WT1）在间皮细胞中表达较好，其表达率在良、恶性胸水中比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论利用细胞团块联合免疫标记能极大地提高良、恶性胸水诊断的准确率，并能客观地对恶性肿瘤细胞进行分型，提高癌细胞检出率、准确率，有利于肿瘤分型。

细胞团块收集器；良、恶性胸水；肺腺癌；免疫标记

胸、腹水脱落细胞检查，可用于判断胸、腹水的良、恶性及恶性肿瘤类型和来源，为临床诊治、判断预后提供科学依据。传统的细胞涂片或液基薄层细胞涂片技术因为细胞数量有限，细胞重叠堆积、薄厚不均、结构不清，所以恶性肿瘤细胞检出率、准确率较低。本研究利用细胞团块收集器收集体液标本中细胞的方法，收集胸水中脱落细胞，并检测间皮细胞（mesothelial cell，MC）、甲状腺转录因子-1（thyroid transcriptionfactor-1，TTF-1）、Calretinin、Napsin-A、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、Ki-67、细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）等，结合苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）病理形态鉴别良、恶性胸水，并进行肿瘤分型，为治疗提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1材料与试剂

选取甘肃省白银市第一人民医院2014年1月-2014年9月临床送检胸水标本115例，所有标本利用细胞团块收集器制作细胞团块。同时收集2009年1月-2013年1月病理科胸水脱落细胞诊断结果。细胞团块收集器、蛋白螯合剂为本实验室研发；免疫组织化学法染色过程所需单克隆抗体：Ki-67、Calretinin、MC、CEA、Wilms肿瘤基因（Wilms'tumor gene，WT1）、TTF-1、Napsin-A、CK7及鼠抗人单克隆抗体CK5/6，试剂盒UltraSensitive SP购自福州迈新生物技术开发有限公司，按试剂盒说明书进行操作，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作阴性对照组。

1.2实验方法

临床抽取的胸、腹水标本除做其他检查外，其余全部立即送检，一般为200～800 ml。将胸水标本测量体积，按照1∶10的比例加入4％甲醛溶液，标本以10％福尔马林固定。自然沉降30～60 min，弃上清液，留沉淀物30～50 ml，置入50 ml离心管中，2 000 r/min离心10 min。弃上清液，取沉淀物1～2滴进行常规涂片，并在剩余沉淀物中加入1 ml 95％乙醇，混匀沉淀物，加入1滴蛋白螯合剂，混匀；将混合液全部置入细胞团块收集器中，2 000 r/min离心10 min，取出细胞团块，包埋、常规脱水、透明、浸蜡后包埋，制成4μm厚的细胞块石蜡切片，HE染色，免疫组织化学法检测，细胞切片和细胞涂片对比观察，鉴别胸水的良、恶性，同时诊断肿瘤类型。

1.3结果判断

细胞学诊断标准参照《细胞病理学诊断图谱及实验技术》[1]。所有涂片、切片经2位有经验的病理科副主任医师阅片，胸水癌细胞阳性患者，需经病理活检资料证实或临床综合资料的验证；免疫组织化学法染色中Calretinin、MC、CEA、Napsin-A、CK7、CK5/6蛋白在细胞膜中表达，Ki-67、WT1、TTF-1蛋白在细胞核中表达，为棕黄色颗粒；阳性细胞率＞10％为阳性[2]。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以率表示，两两间用χ2检验并行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.12009～2014年同期胸水标本癌细胞检出率

本实验室对2009～2014年1～9月份同期胸、腹水标本癌细胞检出率进行分析，统计结果显示，2009～2013年1～9月份使用传统细胞涂片或液基薄层细胞涂片技术，胸、腹水癌细胞检测阳性率为5％；2014年同期使用团块收集器，胸、腹水癌细胞检测阳性率为16％，是以往普通涂片胸、腹水癌细胞检测阳性率的3倍多，差异有统计学意义（χ2=7.856，P=0.023）（见表1）。分析其原因：①关键是不能对送检胸、腹水所有细胞进行检测；②细胞涂片免疫组织化学法效果没有细胞切片免疫组织化学法效果好（见图1～4）。

2.2免疫组织化学表达特点

表1 2009～2014年同期胸、腹水标本癌细胞检出率

31例核异型性胸水中，病理细胞学检查发现17例肺腺癌，1例为神经内分泌癌，并得到组织学证实。在17例肺腺癌中，CEA、TTF-1、Napsin-A及CK7全部表达，Calretinin、MC不表达，WT1＜20％，Ki-67增殖指数为（25.47±24.0）。Ki-67、Calretinin、MC、CEA、TTF-1、Napsin-A及CK7在间皮细胞增生及肺腺癌间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），WT1、CK5/6在间皮细胞增生及肺腺癌间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

图1 细胞涂片见巢团状、单个排列的瘤细胞，细胞结构模糊（HE×200）

图2 细胞切片中见腺样排列的瘤细胞（HE×200）

图3 组织切片见癌组织成乳头状、腺管状、条索状排列，浸润至纤维间质（HE×200）

图4 免疫组织化学结果，癌细胞CK7+（×200）

表2 31例核异型性胸水患者的免疫组织化学表达特点

3 讨论

胸、腹水脱落细胞检查是判断良、恶性及恶性肿瘤类型和来源的主要手段，为临床诊治、判断预后提供科学依据。引起胸、腹水常见的原因有肺癌、乳腺癌、卵巢癌、消化道肿瘤、淋巴瘤及间皮瘤等，准确判断胸、腹水中细胞是间皮细胞还是肿瘤细胞，或其他类型肿瘤细胞，为临床治疗和预后提供重要依据。传统的细胞涂片或液基薄层细胞涂片技术由于细胞数量多，涂片厚，免疫组织化学法难以进行质量控制，在鉴别诊断中存在困难[3]。

本实验室研发一种细胞团块收集器及收集方法，极大地提高恶性肿瘤细胞检出率及准确率。利用细胞团块收集器制作法，收集脱落细胞制作石蜡包埋切片具有以下优点：①可以把患者送检的胸、腹水、尿液等体液标本固定细胞后全部包埋切片，可连续切片，减少漏诊，提高脱落细胞的阳性检出率。②克服传统涂片中细胞重叠堆积、薄厚不均、结构不清的现象，确保对细胞学的正确诊断。③可长期保存，反复重切，并能做多种特殊染色或免疫组织化学法检测，对恶性肿瘤的分类有很大帮助，减少误诊，为临床治疗提供依据和方便。该方法具有很大的推广和应用前景[4]。

研究发现，Napsin-A对原发性肺腺癌、鳞状细胞癌及其他转移性恶性肿瘤的诊断具有较高的敏感性和特异性[5-7]。本实验显示，原发性肺腺癌中Napsin-A呈强阳性，表达率为100％，具有较高的特异性；其在转移性腺癌、鳞癌及肺良性胸腔积液中未见阳性表达，与相关报道一致[8]。国内外关于TTF-1在肺癌中的研究报道较多，且研究结果显示，TTF-1主要在肺腺癌和小细胞癌中表达，肺腺癌中TTF-1的阳性表达率为27％～100％[9]。同时TTF-1在原发性肺腺癌中的表达具有较高的敏感性和特异性，可作为一种有价值的标记物，用于原发和转移性肺腺癌的鉴别；本研究显示，TTF-1表达率为100％，具有较高的特异性，与相关报道一致[10]。CK7是许多腺上皮及移行上皮中的一种碱性角蛋白（如肺、乳腺、卵巢等），CEA是一种胎儿肠道产生的癌胚抗原，在肺腺癌中高表达。Calretinin是一种细胞内钙结合蛋白，和MC主要在正常和肿瘤性间皮细胞中表达。Ki-67是判断细胞增殖活性的指标，其高、低与许多肿瘤的分化程度、浸润转移及预后密切相关。

综上所述，通过细胞团块收集器及收集方法联合检测Ki-67、Calretinin、MC、CEA、WT1、TTF-1、Napsin-A、CK7及CK5/6免疫标记物，可鉴别良、恶性胸水，是判断反应性间皮细胞和肿瘤细胞组织学来源的较好指标。

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（童颖丹 编辑）

Application of cell mass collector combined with immune markers in diagnosis of benign and malignant pleural effusion*

Jun-ping HAN1,Li-zeng WANG1,Wen-xiao LUO1,Wen-xia MA1,Chun-he DA2
(1.Department of Pathology,2.Department of Respiratory Diseases,the First People's Hospital of Baiyin,Baiyin,Gansu 730900,P.R.China)

【Objective】】To apply cell mass collector combined with immune markers in the diagnosis of benign and malignant pleural effusion.【Methods】Pleural effusion of 115 cases was collected with the cell clump collector.Effusion smears were checked through H.E.staining and immunohistochemical staining.Cell morphology was observed and differential diagnosis was made.Then the results were compared with the diagnostic results of traditional cell smear and thin liquid layer technology for pleural effusion from 2009 to 2013.【Results】In 115 cases with pleural effusion,18 cases were confirmed to have malignant pleural effusion by immunohistochemistry and morphology.The positive rate of malignant cells was 16％while it was 5％using traditional cell smear of pleural effusion,and there was a significant difference between them(P＜0.05).CEA,Napsin-A,TTF-1,CK7 and Ki-67 were expressed in the lung adenocarcinoma cells,while MC,WT1 and calretinin were expressed in mesothelial cells,and there were significant differences in the positive rates between benign and malignant pleural effusion(P＜0.05).【Conclusions】Application of cell mass collector combined with immune markers can improve the diagnosis of benign and malignant pleural effusion,increase the detection rate and accuracy and facilitate classification of malignant tumor cells.

cell mass collector;benign and malignant pleural effusion;lung adenocarcinoma;immune marker

R365

A

1005-8982（2015）35-0062-04

2015-05-26

甘肃省卫生行业科研计划项目（No：GSWSKY-2015-69）