蛹虫草液体发酵产纤溶酶酶学性质的研究

张鹤

华北制药金坦生物技术股份有限公司

蛹虫草液体发酵产纤溶酶酶学性质的研究

张鹤

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心脑血管疾病严重威胁人类健康，溶栓剂的研究与开发具有重大的经济效益和社会效益。溶栓剂来源广泛，其中微生物来源的溶栓剂展现出诱人的前景。本实验通过对20种大型真菌进行筛查，研究发现蛹虫草深层培养发酵液中具有纤溶活性物质，目前发现蛹虫草纤溶酶中有两个活性组分，本实验对蛹虫草纤溶酶第三活性组分相关酶学性质进行研究。由SDS-PAGE测定蛹虫草纤溶酶由单个亚基组成相对分子量约为28000Da；蛹虫草纤溶酶具有直接纤溶活性，对纤溶酶原的激活作用不明显。

蛹虫草；纤溶酶；酶学性质

1.实验材料

蛹虫草纤溶酶（经纯化后获得的第三组分）、透析袋、低分子量标准蛋白、β-巯基乙醇、琼脂糖、考马斯亮兰R-250、溴酚兰、凝血酶、牛血纤维蛋白原、α-萘酚、胃蛋白酶。

2.实验方法

2.1.SDS-PAGE法测定蛹虫草纤溶酶相对分子质量

①样品处理方法：精提纯后的酶液经透析除盐，再将其浓度浓缩至2mg/mL，取15μl样品，加入等体积变性样品溶解液，电泳前煮沸3～5min。

②选择凝胶浓度为12%（w/v）的分离胶，5%（w/v）的浓缩胶，交联度为2.6%，灌注于双垂直板电泳模具中。

③电泳方法：上样后，先恒电压80V，待样品进入分离胶后恒电压120V，当含有溴酚蓝指示剂的前沿到达凝胶底部时结束电泳，大约要3～4h。

④固定、染色和脱色：电泳完毕后，小心取出凝胶，在15%(w/v)三氯乙酸固定液中固定过夜，再用考马斯亮兰R250染色液染色4h，然后用脱色液脱色，直至背景清晰无色。最后用凝胶成像系统分析测定目标蛋白的相对分子量。

2.2.虫草纤溶酶对纤溶酶原的激活作用

市售的纤维蛋白原大都混有纤溶酶原，如果将配制好的血纤维平板在85℃下保温30min，则可以使纤溶酶原失活，经过这样处理的平板称为阴性平板，在此平板上形成溶圈显示的是纤溶酶的直接纤溶活性，不经过此处理的平板称为阳性平板。通过对比阴阳性平板上透明溶圈的大小可以检验纤溶酶是否具有激活纤溶酶原的活性。测定时，分别点同一酶样10μL于阳性和阴性平板上，平行点五次，然后比较蛹虫草纤溶酶在阳性和阴性平板上的活性差异，若两者相差较大，即表明此蛹虫草纤溶酶有激酶活性，若两者差异较小，即此蛹虫草纤溶酶的纤溶酶原激酶活性不明显。

2.3.虫草纤溶酶对人血纤维蛋白原的降解情况

将2%人血纤维蛋白原23μL与23μL 0.01mg/mL的酶液混匀置于离心管中于37℃分别保温30S、1min、5min、10min、2h、4h、6h、 8h、12h，定时快速取出加入10μL等体积样品溶解液，沸水浴终止酶促反应。将保温不同时间的反应液进行SDS-PAGE垂直板电泳，电泳时加入还原的人血纤维蛋原作对照，通过观察α、β和γ链的含量变化确定该纤溶酶对人血纤维蛋白原各亚基的降解情况。

3.实验结果

3.1.SDS-PAGE法测定蛹虫草纤溶酶相对分子质量

本实验选择交联度为2.6%，凝胶浓度为12%，选用的标准蛋白分子量范围是14,400～97,400Da。

用SDS-PAGE测定经分离纯化后的蛹虫草纤溶酶纯酶样品的相对分子质量。经电泳检测并应用凝胶成像系统的Labworks软件分析出该亚基相对分子质量约为28000Da。

3.2.虫草纤溶酶对纤溶酶原的激活作用

用加热血纤维蛋白平板法测定蛹虫草纤溶酶对人纤溶酶原是否有激活作用，比较阳性和阴性平板上的活性差异，若阳性平板的溶圈明显比阴性平板的大，即表明此蛹虫草纤溶酶有纤溶酶原激酶活性，若两者无明显差异，即此蛹虫草纤溶酶的纤溶酶原激酶活性不明显。

通过对平板的观察，蛹虫草纤溶酶在阴性平板上的溶圈直径比阳性平板的溶圈直径小，因此可以判断此蛹虫草纤溶酶不但可以直接降解血纤维蛋白，而且具有激活纤溶酶原转化成纤溶酶共同参与溶栓的作用。

3.3.虫草纤溶酶对人血纤维蛋白原的降解情况

本实验用SDS-PAGE检测蛹虫草纤溶酶对人血纤维蛋白原的降解规律，分离胶浓度选择12%，降解图谱如图2-9，30S后α链就开始降解，1min后α链和β链都完全降解，2h后γ链降解完毕，这一降解顺序与人纤溶酶降解纤维蛋白原各亚基的情况是一样的。

4.结论

本文以蛹虫草为菌种液体发酵生产纤溶酶，对纯化后的纤溶酶的酶学性质做了研究。得出以下结论：①蛹虫草纤溶酶的酶学性质此蛹虫草纤溶酶的相对分子质量约为28000Da。②Aprotinine和SBTI对此蛹虫草纤溶酶的活性有明显抑制作用，由此可以判断出这种新型纤溶酶可能是丝氨酸蛋白酶。③该酶可以顺次降解人血纤维蛋白的α、β和γ三个亚基。该酶不但可以直接降解血纤维蛋白，而且具有激活纤溶酶原转化成纤溶酶共同参与溶栓的作用。

[1]祁辉，余蓉，李晓红等.一株诱变枯草杆菌溶栓酶性质研究的初探.预防医学情报杂志,2003，19(1)：5-7

[2]吴冠芸，潘华珍，吴翠.生物化学与分子生物学实验常用数据手册（第一版）.科学出版社，1999

[3]李建武，萧能赓，余瑞元，等.生物化学实验原理和方法（第一版）.北京：北京大学出版社，2002，168～170