饮用水中秋水仙碱含量预警的在线监测方法

朱曜，刘爽，张旭辉，唐书泽

(1.暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；2.广东省疾病预防控制中心，广东 广州 510300)

近年来发生的突发性引用水污染事件中，人为饮用水投毒难以被及时发现[1–2]。建立饮用水有毒有害物质预警的在线检测系统，及时切断被污染水源，减少事故损失[3–4]，对饮用水安全应急管理具有重要意义。秋水仙碱是一种毒性极强的生物碱，LD50 仅为4mg/kg[5]，存在于百合科水仙的球茎、种子以及食品鲜黄花菜中。秋水仙碱中毒事件频频发生，如2004年扬州大学副教授秋水仙碱投毒案和2013年秋水仙碱外遇投毒案，但因规模较小并未引起足够重视。目前测定秋水仙碱含量的方法很多，主要有荧光光度法、比色法、薄层色谱扫描法、高效液相色谱法等[6–8]，但上述方法大都操作复杂，灵敏度较低，且必须间断式采集样品进样，无法实现对饮用水中秋水仙碱的快速检测。近年来，流动注射化学发光法以其仪器简单、灵敏度高、操作方便等优点被广泛应用到食品、药品、环境监测等领域[9–12]。该方法可连续进样，实时采集饮用水样品检测，故可以对饮用水水质进行在线监测。笔者研究秋水仙碱含量对鲁米诺–铁氰化钾流动注射化学发光体系发光强度的影响[13–15]，采用响应面优化法得到最优的检测条件[16]，并结合在线监测报警技术[17]建立了一种对饮用水中秋水仙碱预警的方法[18–20]，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器：IFIS–C 型智能流动注射进样器；RFL–1 型超微弱化学发光/生物发光检测仪(西安瑞迈电子科技有限公司)；DHG–9145A 型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；PHS–3C 数字式 pH 计(上海精密科学仪器有限公司)；EL104 电子天平(梅特勒–托利多仪器有限公司)；微量移液枪0.1 ～ 1.0mL、0 ～100 μL(德国BRAND 公司)；超声波仪(西安科导超声波仪器有限公司)。

主要试剂：鲁米诺粉末(Sigma 公司)；铁氰化钾(咸阳市化学试剂厂)；秋水仙碱(铭旺生物公司)；氢氧化钠(分析纯，广州市大茂化学试剂厂)；氯化钙(广州市裕达化学试剂厂)；乙二胺四乙酸二钠(咸阳化学试剂厂)；超纯水。

1.2 进样方法

按图1 连接整个分析流路，A 通道注入秋水仙碱溶液，B 通道注入鲁米诺溶液，C 通道注入铁氰化钾溶液，其中B、C 通道溶液先在三通阀处混合，形成具有化学发光效果的鲁米诺–铁氰化钾体系，再与A 通道溶液混合，进入反应池F 中反应，废液进入废液池W。反应所产生化学发光信号由检测仪检测，通过光电倍增管D 将光信号转变为电信号，并在放大器中放大，变化的电流连接报警装置M，进行实时报警，并最终由计算机软件呈现出峰线图。

图1 在线监测预警示意图 Fig.1 Chart of the FL–CL on-line monitoring and early warning system

1.3 反应机理分析

通过试验分析秋水仙碱—鲁米诺–铁氰化钾化学发光体系的作用机理。

1.4 检测条件的优先

1.4.1 单因素试验

分别考察秋水仙碱溶液质量浓度0.05mg/L 时泵速、鲁米诺溶液pH，鲁米诺溶液浓度、铁氰化钾溶液浓度对相对化学发光强度的影响。

1) 鲁米诺溶液pH 为13.00、鲁米诺溶液浓度2×10–4mol /L、铁氰化钾溶液浓度2×10–4mol /L保持不变，改变泵速，比较泵速分别为0.8、1.0、1.20、1.40、1.60mL/min 时的相对化学发光强度。

2) 泵速1.0mL/min、鲁米诺溶液浓度2×10–4mol/L、铁氰化钾溶液浓度2×10–4mol/L 保持不变，改变鲁米诺pH，比较鲁米诺pH 分别为12.20、12.60、13.00、13.40、13.80 时的相对化学发光强度。

3) 泵速1.0mL/min、鲁米诺溶液pH 为13.00、铁氰化钾溶液浓度2×10–4mol /L 保持不变，改变鲁米诺浓度，比较鲁米诺浓度分别为 0.5×10–4、1.0×10–4、2.0×10–4、3.0×10–4、4.0×10–4mol /L 时的相对化学发光强度。

4) 泵速1.0mL/min、鲁米诺溶液pH 为13.00、鲁米诺溶液浓度2×10–4mol/L 保持不变，改变铁氰化钾溶液浓度，比较铁氰化钾溶液浓度分别为0.5×10–4、1.0×10–4、2.0×10–4、3.0×10–4、4.0×10–4mol/L 时的相对化学发光强度。

1.4.2 响应面优化检测试验

根据Box–Behnken 中心组合设计原理，进行四因素三水平(表1)响应面优化检测试验，并用Design Expert 8.0 软件对试验数据进行回归分析。

表1 响应面优化检测试验的因素和水平 Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4.3 标准曲线的绘制和精密度及检出限的确定

采用梯度稀释法，配制0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000mg/L 的秋水仙碱溶液，在优化后的试验条件下，测定相对化学发光强度。以秋水仙碱浓度为横坐标，以相对化学发光强度为纵坐标绘制标准曲线，并计算精密度和检出限。

1.4.4 干扰试验和加标回收

在优化试验条件下进行干扰影响试验，秋水仙碱质量浓度为0.05mg/L，加入常见的干扰离子，观测化学相对发光强度变化。

在优化后的试验条件下，测定实验室自来水、宿舍自来水、怡宝纯净水中秋水仙碱含量，之后进行秋水仙碱0.05mg/L 的加标回收试验。

1.5 报警系统原理图设计

为了对突发事件进行在线实时预警，在监测系统中加入报警器来提醒检测人员，以便从理论上设计出一套相对完整的检测报警系统。

2 结果与分析

2.1 反应机理

试验结果表明，75 s 时在鲁米诺–铁氰化钾体系中注入0.05mg/L 的秋水仙碱溶液对发光强度有明显抑制作用，其抑制程度即相对化学发光强度与秋水仙碱溶液浓度呈正相关关系。体系的反应机理可能是鲁米诺被铁氰化钾氧化成为激发态的3–氨基邻苯二甲酸根阴离子，其化学发光的最大波长为425 nm。同时秋水仙碱是一种有机胺类生物碱，可被铁氰化钾氧化，与鲁米诺产生竞争性抑制，从而抑制了体系的化学发光强度。

2.2 检测条件的优化结果

2.2.1 单因素试验结果

1) 泵速的选取。当体系的流动注射速率一定时，在较低浓度范围内，载流泵速和相对化学发光强度成正相关，在泵速超过1.00mL/min 时相对发光强度最大；当泵速较高时，相对化学发光强度降低并趋于稳定，故选取泵速为1.00mL/min。

2) 鲁米诺溶液pH 的选取。在碱性环境中鲁米诺溶液有较好的化学发光特性，随着pH 的升高，相对化学发光强度不断增强，在pH 为13.00 时相对发光强度最大，之后随着pH 的升高相对发光强度下降，故选取鲁米诺pH 为13.00。

3) 鲁米诺溶液浓度的选取。鲁米诺溶液浓度较低时，相对化学发光强度较弱，当浓度达到2×10–4mol /L 时，相对发光强度显著增高，之后随着浓度的升高，发光强度呈降低的趋势，故选取鲁米诺溶液浓度为2×10–4mol/L。

4) 铁氰化钾溶液浓度的选取。铁氰化钾溶液浓度增大时，相对化学发光强度也随之增强，在浓度为2×10–4mol /L 时化学发光强度最大，随后随着浓度的增大，相对化学发光强度趋于平稳。考虑到成本因素，确定铁氰化钾溶液浓度为2×10–4mol /L。

2.2.2 响应面试验结果

根据中心复合模型，采用29个试验点(5个中心点)进行响应面分析试验，其中共有24个析因点，自变量取值在各因素构成的三维顶点；5个重复零点是区域的中心点，用以估计试验误差，响应值是相对发光强度(表2)。相对发光强度(y)和各因素变量（x1、x2、x3、x4分别表示因素A、B、C、D）的二次回归方程为：y=610.40–47.33x1+64.50x2+76.67x3+ 16.67x4+

表2 响应面法试验结果 Table 2 Results of response surface experiment

2.2.3 回归方程的显著性检验

从表3 可以看出，回归方程的失拟项较小，说明该方程对试验拟合情况较好，误差小，所以，可以用该回归方程代替试验真实点对结果进行预测和分析。由表3 还可以看出，鲁米诺溶液浓度(x3)、鲁米诺溶液pH(x2)、泵速(x1)、铁氰化钾溶液浓度(x4)对相对发光强度的影响依次减小。

2.2.4 响应面法分析结果

由图2 可知：鲁米诺溶液浓度对相对化学发光强度的影响最大，表现为曲面弯折度较大；其次为鲁米诺溶液pH，再次为泵速，而铁氰化钾溶液浓度对结果的影响不明显，表现为曲面较为平滑，其中，图f 的曲面最陡，表明鲁米诺溶液pH 和鲁米诺溶液浓度的交互作用对结果的影响最大。

图2 4 因素交互作用的响应面分析结果 Table 2 Results of response surface analysis from the interactive effects among four factors

2.2.5 最优检测条件的预测与验证

根据以上结果，结合软件最优化预测功能，预测得到秋水仙碱的最优检测条件：泵速 0.92mL/min；鲁米诺溶液pH 13.20；鲁米诺溶液浓度3.08×10–4mol/L；铁氰化钾溶液浓度 2.56×10–4mol/L；相对发光强度为654.735。

根据结果进行验证试验，检验试验结果是否与真实情况相一致。综合考虑实际条件后对最佳工艺条件进行修正：泵速1mL/min；鲁米诺溶液pH 13.20；鲁米诺溶液浓度3.00×10–4mol/L；铁氰化钾溶液浓度3.00×10–4mol/L。3次平行试验的相对化学发光强度平均值为645.580，相对误差较理论最优值偏低1.3%，重复性好，说明优化结果可信。

2.2.6 标准曲线和精密度及检出限

秋水仙碱质量浓度为0.005～0.050mg/L 和0.05～ 1.00mg/L 时，秋水仙碱浓度和相对化学发光强度呈较好的线性关系，其回归方程分别为y=3 044.3x+ 198.05 (R2=0.994 7)和 y=304.96x+334.82 (R2=0.997 8)。对0.05mg/L 的试样进行11次平行测定，测出相对标准偏差为2.78%。根据IUPAC 的相关规定，计算检出限为3.01×10–5mg/L。

2.2.7 干扰掩蔽试验和加标回收试验结果

干扰允许限为±5%时，1 000 倍的K+、Na+、Cl–、PO3–、NO3–对试验无干扰；4 倍的 Mg2+、Ca2+和 1 倍的 Fe3+、Fe2+、Cu2+对发光体系有略微促进作用。通过加入体积分数2.5%的0.2 mol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)对其掩蔽，掩蔽效果良好(表4)。

表4 饮用水秋水仙碱0.05mg/L 的加标回收试验结果 Table 4 Colchicine detection with 0.05mg/L standard addition in drinking water

2.3 报警系统工作原理

报警器与流动注射化学发光法仪的光电倍增管相连，当检测到引起相对化学发光强度变化的物质时，荧光信号会在光电倍增管中转化成变化的电流信号，进而通过比较电路转化为相应的电压差，这种电压差通过单态触发器和多谐振荡器使报警器工作(图4)。

图3 报警器工作原理 Fig. 3 Operating principle of the alarm apparatus

3 结论

利用秋水仙碱能显著抑制鲁米诺–铁氰化钾化学发光体系发光的特点，建立了一种在线饮用水中秋水仙碱预警的方法，该方法经响应面法优化后，检出限可达3.01×10–5mg/L，线性范围为0.005～0.05mg/L 和0.05～1.00mg/L。本方法具有灵敏度高、操作方便、实时预警等特点，能够及时测出饮用水中秋水仙碱含量并报警，从而可避免大规模饮用水安全事故的发生。

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