高效液相色谱法测定芒草60Co γ 辐照降解副产物

李夏洁，李清明,*，苏小军，熊冬梅，胡秋龙，熊兴耀

(1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙410128；3.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

芒草是禾本科多年生草本植物，适应性强，产 量高[1]，在中国资源丰富，是一种优良的制取燃料乙醇的木质纤维素原料。中国在《生物质能源“十二·五”规划》中把木质纤维素制取燃料乙醇的研究作为重点项目[2]。木质纤维素是由纤维素、半纤维素和木质素紧密结合构成的，它很难被纤维素酶水解成单糖而发酵成乙醇，因此，在酶解木质纤维素原料前通常要经过预处理来打破它的结构。预处理是在高温、高压和辐射或强酸、强碱等条件下进行的，因此，原料在结构被打破的同时还会发生一些降解作用，从而产生一些不可用于制取乙醇的降解副产物。这些副产物有的对后续酶解、菌种发酵有抑制作用，有的具有可利用价值，如香草醛可用作化妆香精和治疗癫痫病，对香豆酸对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌及绿脓杆菌等均有不同程度的抑制作用，等等，因此，定性、定量检测木质纤维素预处理后的降解副产物对后续酶解、菌种发酵的脱毒以及副产物的有效利用等具有重要意义。

木质纤维素降解副产物主要包括酚类化合物、呋喃类化合物和有机酸[3–4]等3 大类。原料不同，所用的预处理方法也不同，所产生的抑制物种类及含量也不一样[4–5]。经60Co γ 辐照预处理芒草中含量较高且对后续酶解、发酵有抑制作用的降解副产物较多，主要包括香草醛、香草酸、对羟基苯甲酸、4–羟基苯甲醛、对香豆酸、丁香酸等6 种酚类化合物和糠醛等呋喃类化合物以及甲酸、乙酸等有机酸[6]。不同类型副产物的化学性质不同，用高效液相色谱法对其进行检测的检测条件也不一致，要同时检测出这几种不同类型的物质，常需要对检测条件进行摸索。虽然已有关于糠醛[7]、酚类化合物[8–9]、有机酸[10–11]高效液相检测的研究，但关于同时定量检测出这些目标化合物的方法尚未见报道。笔者探寻芒草经60Co γ 辐照后的主要降解副产物的高效液相色谱定量检测方法，并用建立的方法测定 1 200 kGy60Co γ 辐照芒草中各目标化合物的含量，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

芒草采自湖南农业大学教学科研基地。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：甲醇和乙腈(色谱纯，CNM 公司)；浓盐酸、乙酸乙酯和无水硫酸镁(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸(分析纯，金华大化学试剂有限公司)；磷酸氢二铵(分析纯，西陇化工股份有限公司)。水为超纯水。

标准品：香草酸(纯度98%，国药集团化学试剂有限公司)；丁香酸和对香豆酸(纯度98%，西亚试剂公司)；对羟基苯甲酸和4–羟基苯甲醛(化学纯，国药集团化学试剂有限公司)；香草醛、糠醛、甲酸和乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

主要仪器：中草药粉碎机(广州华凯机电设备有限公司)；BS224S 型电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；Agilent 1260 Infinity 液相色谱仪(配有紫外可变波长检测器VWD、Agilent 化学工作站和150 mm×4.6 mm，5 μm ZORBAX SB–C18柱，美国Agilent公司)。

1.3 试验条件的确定

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取上述9 种标准品，用5%的乙腈–水溶液(用磷酸调pH 至2.7)分别配制如下单标准溶液作为贮备液：质量浓度50mg/L 的对羟基苯甲酸；50mg/L 的香草酸；25mg/L 的丁香酸；50mg/L 的4–羟基苯甲醛；50mg/L 的香草醛；75mg/L 的对香豆酸；50mg/L 的糠醛；50mg/L 的甲酸；50mg/L 的乙酸。以9 种单标准溶液为基础，配制含9 种标准品的混合标准溶液，置于4℃冰箱中备用。

1.3.2 芒草预处理

辐照处理在湖南省辐射技术应用研究中心进行。试验采用60Co γ 辐照源，源强为9.99×1015Bq，剂量率为2 kGy/h。将准备好的试验材料置于辐射场中，于室温条件下进行照射，选用辐照剂量为 1 200 kGy 的样品。辐照后将样品用中草药粉碎机粉碎，装入磨口玻璃瓶中备用。

1.3.3 辐照芒草中目标化合物的提取

称取1.00g 的芒草辐照样品，加入20mL 蒸馏水，在80℃时恒温水浴30min，过滤，取滤液。先用浓盐酸调节滤液的pH 值至2.0，再用等体积的乙酸乙酯萃取3次，混匀收集有机相，然后用无水硫酸镁脱水，抽滤，除去沉淀。有机相于63℃、0.085 MPa 下减压旋转蒸发至干后，用20mL 5%的乙腈–水溶液(用磷酸调pH 至2.7)溶解。

1.3.4 色谱条件

色谱柱为ZORBAX SB–C18柱。流动相 A 相为0.01 mol/L 磷酸氢二铵溶液(用磷酸调pH 至2.7)，B相为乙腈。梯度洗脱程序为：0～25min B 相占流动相的比率为5%～20%；25～30min B 相占流动相的比率为20%～80%；30～35min B 相占流动相的比率为80%～5%；35～40min B 相占流动相的比率为5%。柱温 25℃； 多波长(205、218、230、256、280、310 nm)进行检测；流速为0.8mL/min；进样量为10 μL。

2 结果与分析

2.1 辐照芒草中目标化合物分离条件的确定

2.1.1 检测波长的选取

用液相对9 种物质的标准品分别进行全波长(190～400 nm)检测，以确定各物质的最大吸收波长，结果表明，各标准品的最大紫外吸收波长有明显差异。甲酸、乙酸、糠醛、对羟基苯甲酸的最大吸收波长分别为206、204、278、256 nm，香草酸、丁香酸的最大吸收波长均为218 nm，4–羟基苯甲醛、香草醛、对香豆酸的最大吸收波长分别为284、230、310 nm。综合考虑后确定检测波长为205、218、230、256、280、310 nm。

2.1.2 流动相的选取

2.1.2.1 流动相中有机溶剂的选取

分别以甲醇和乙腈作为流动相中的有机溶剂，比较各目标化合物的分离效果及峰形，结果表明，在选用甲醇作为流动相中的有机溶剂时，混标的HPLC 色谱图中4–羟基苯甲醛和香草醛2个峰之间出现连峰，甲酸、乙酸的单标HPLC 色谱图中有基线干扰现象。这可能是因为乙腈截止波长为190 nm，甲醇截止波长为205 nm，而样品所用的检测波长应大于流动相截止波长20 nm 左右。选用乙腈作为流动相中的有机溶剂时，各目标产物峰形窄尖，在达到有效分离的同时缩短了整个分析时间(表1)，且乙腈的灵敏度比较高，柱压低，故选择乙腈作为流动相中的有机溶剂。

表1 以甲醇–水溶液和乙腈–水溶液为流动相时各目标化合物的保留时间 Table 1 Retention time of the target chemicals at two flowing phases of methanol-water solution and acetonitrile-water solution

2.1.2.2 酸种类的选取

酚类化合物容易产生解离，甲酸、乙酸均为弱酸，在水溶液中也会解离，以非单一的形式存在，这容易导致色谱峰形变宽、拖尾和不对称等现象出现，因此，可以在流动相中加入酸来抑制上述化合物的电离，使它们能够以分子的形式在反相柱上保留。液相色谱的分离效果与酸的种类有关[12]，目前，用液相检测酚类化合物时多数是利用乙酸[13]或甲酸[14]对流动相进行pH 调节，本试验中需要在低紫外检测波长下进行检测，而作流动相的物质在检测波长附近应没有吸收，否则，会有基线干扰，因此，选择磷酸作为pH 的调节剂。

2.1.2.3 流动相中缓冲盐的选取

缓冲盐溶液能够有效改善峰形，影响酸存在形式的稳定性，从而影响分离效果。芒草样品的成分复杂，含有多种杂质，如果没有缓冲盐溶液的缓冲就会形成负峰[15]。磷酸氢二铵是在检测波长处无吸收的弱酸电离抑制剂，因此，本试验中选择磷酸氢二铵为缓冲盐溶液。

2.1.2.4 流动相pH 的选取

在柱温35℃、流速0.8mL/min 的条件下，用磷酸调节流动相中磷酸氢二铵盐溶液pH 进行单因素试验的结果见表2。由表2 可知，pH 对目标化合物分离效果和保留时间的影响不明显。

表2 不同pH条件下各目标化合物的保留时间 Table 2 Retention time of the target chemicals at different pH values

随着pH 值增大，香草醛和对香豆酸的保留时间间隔逐渐变小，分离度变小，在pH 为3.3 时，香草醛和对香豆酸的分离度为1.37(通常分离度大于等于1.5 才视为2个峰完全分离)，因此，pH 为3.3 时香草醛和对香豆酸的分离度不够，形成连峰。因为长时间使用过低的pH 会引起色谱柱键合相的损失，而且可能导致基线严重漂移[16]，所以，综合考虑后确定流动相pH 为2.7。

2.1.3 流速的选择

在35℃、流动相中盐溶液pH 为2.7 的条件下分别设置流速0.5、0.8、1.0、1.2mL/min 进行单因素试验的结果见表3。由表3 可知，流速对分离度和各峰保留时间的影响较大。流速越大，各峰的保留时间明显提前，使得整个分析时间大大缩短。流速在0.5mL/min 时，香草醛和对香豆酸出峰时间重叠；流速为1.0mL/min 时，丁香酸和4–羟基苯甲醛出锋不能完全分开；流速为1.2mL/min 时，丁香酸和4–羟基苯甲醛的出峰时间重叠；流速为0.8mL/min 时，各峰分离效果较好，且整个分离时间较为合适，所以，本试验中确定流速为0.8mL/min。

表3 不同流速条件下各目标化合物的保留时间 Table 3 Retention time of the target chemicals at different flowing velocities

2.1.4 柱温的选择

在流动相中盐溶液pH 为2.7、流速为0.8mL/min 的条件下，分别设置柱温20、25、30、35、40℃进行单因素试验，结果(表4)表明，随着柱温升高，大部分目标化合物的保留时间有所提前，其中香草醛和对香豆酸、丁香酸和4–羟基苯甲醛的分离度逐渐减少。在柱温为40℃时，HPLC 色谱图中的香草醛和对香豆酸的色谱峰相连，又因缓冲盐在较低温时易结晶析出，对色谱柱有不利影响，所以，综合考虑各色谱峰的分离度和峰形后确定柱温为25℃。

表4 不同柱温条件下各目标化合物的保留时间 Table 4 Retention time of the target chemicals at different column temperatures

2.1.5 洗脱梯度的选择

以0.01 mol/L 磷酸氢二铵盐溶液(用磷酸调pH 为2.7)为A 相，以乙腈为B 相，在流速0.8mL/min、柱温为25℃的条件下设置3个梯度洗脱条件(表5)。

表5 洗脱梯度条件 Table 5 Elutiongradient conditions

由表6 可知，在0～25min，随着B 相所占比率的增加，各目标化合物的保留时间提前，分离度也降低。在梯度3 中，香草醛和对香豆酸的色谱峰相连，香草酸和丁香酸的色谱峰相连。在梯度1、2 中，各目标化合物达到基线分离，且分离效果较好，但考虑到芒草样品成分复杂，目标化合物分离度稍大，两物质之间干扰较小，因此，确定洗脱梯度条件为表5 中的梯度1。

表6 不同梯度条件下各目标化合物的保留时间 Table 6 Retention time of the target chemicals at differentgradient conditions

2.2 标准曲线的制作

将单一标准品对比混合标样的色谱图进行分析，通过对比各峰保留时间的位置，确定9 种目标产物的相应峰位。图1 为目标产物混合标准溶液的HPLC 色谱图。

图1 混合标准溶液的HPLC色谱图 Fig.1 HPLC chromatogram of a mixed standard solution

对1.3.1 中配制的标准溶液里各目标化合物浓度进行稀释，得到5个浓度梯度的混合标准溶液。各浓度梯度的混标按前述色谱条件分别进样10 μL，以质量浓度X(mg/L)对峰面积Y 绘制标准曲线。其保留时间、线性回归方程和检出限(信噪比为3)结果如表7 所示。对芒草辐照预处理物料热水浴萃取物进行加标回收试验，样品重复进样测定6次；加入待测物标准品后再重复进样测定6次，计算加标回收率及相对标准偏差，结果见表7。由表7 可知，各目标化合物的加标回收率均高于96%，相对标准偏差＜2.5%(n=6)，结果满足定量分析要求。

表7 9 种目标化合物的保留时间、线性回归方程、检出限、加标回收率和精密度(n=6) Table 7 Retention time，linear regression equation，detection limit，recovery and precision of 9 kinds of target chemicals (n=6)

2.3 芒草辐照预处理后目标化合物的测定

取经1 200 kGy60Co γ 辐照后的芒草，按照1.2.3 中的方法提取芒草降解副产物样品。在优化后的色谱条件下测定样品中9 种目标化合物的含量，其色谱分离结果如图2 所示。

图2 芒草辐照预处理样品水提液的HPLC谱图 Fig.2 HPLC chromatogram from the water extracts of miscanthus pretreated with irradiation

由图2 可知，HPLC 法可用于对芒草辐照预处理后主要降解副产物的定量分析，9 种主要降解副产物的分离效果较好。计算结果表明，芒草水提液中甲酸、乙酸、糠醛、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4–羟基苯甲醛、香草醛和对香豆酸的质量浓度分别为102.29、86.24、2.52、17.78、12.43、3.26、15.40、10.18、16.42mg/L。

3 结论与讨论

本研究中同时检测出了木质纤维素原料中的3大类副产物，跟江智婧等[9]的方法相比，在目标物达到有效分离的同时大大缩短了整个分析时间，提高了工作效率；与气质联用的方法相比[3,6]，液相色谱法无需硅烷化，克服了气质联用法样品预处理要求高、衍生化不彻底等缺点。建立了同时检测出木质纤维素原料中9 种主要副产物的定量分析方法：采用C18色谱柱，柱温25℃，以乙腈–0.01 mol(NH4)2HPO4(用磷酸调节pH 至2.7) 为流动相，梯度洗脱，流速为0.8mL/min，多波长紫外检测，在此色谱条件下，9 种主要的降解副产物得到了较好的分离，相对标准偏差为1.5%～2.3%，最低检出限为0.10～0.89mg/L，且回收率均在96%以上。该方法具有简易性、实用性、可行性和重复性好等优点。经1 200 kGy60Co γ 辐照处理后的芒草水提液，在4～6min 还检测出了2个明显的峰，按出峰时间推测，这可能是其他有机酸所导致的(蒋怡乐等[6]利用气质联用法定性检测出芒草辐照降解产物中还有乳酸、乙酰丙酸和琥珀酸等有机酸)。芒草辐照降解产物成分复杂，难以全部定性定量，其后续研究与分析还有待开展。

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