拟南芥叶片细胞数直接高效检测体系的建立

李依驰，崔看#，程鹏，陈锦，莫旭东，张小波，肖浪涛，夏石头*

(1.湖南省植物激素与生长发育重点实验室，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

复制因子C(RFC)是一个最初从人类Hela 细胞提取物中纯化出来、在真核生物中普遍存在的保守基因家族，包括1个大亚基(RFC1)和4个小亚基(RFC2–5)[1–4]。RFC 复合物在DNA 复制和修复、细胞周期检测点控制和多细胞生物发育中起重要作用[5–8]。Xia 等[9–10]在用EMS 筛选更多生物和非生物胁迫的抗性突变体时，发现并鉴定出 rfc3–1 突变体中存在一个由G 到A 的点突变。该点突变导致RFC3 中一个非极性脂肪族氨基酸(Gly–85)变成了带负电的氨基酸(Asp)，从而影响了RFC3 与其他亚基的结合，并导致rfc3–1 植株对病原菌的抗性增强，植株生长发育受到明显影响，株型矮小，花瓣变小、变窄，叶片小而狭长。为进一步研究RFC3 基因突变对叶细胞分裂增殖的影响，建立植物叶片细胞直接高效检测体系，以量化分析rfc3–1 的突变性状，笔者以拟南芥野生型(Col)植株和突变体rfc3–1 植株为材料，采用流式细胞仪对叶片细胞数进行计数，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料为拟南芥哥伦比亚生态型野生型植株(Col)和rfc3–1 突变体。

1.2 主要药品与试剂

碘化丙啶(PI)、四盐酸精胺购自Sigma 公司；MES(Methyl Methanesulfonate，甲磺酸甲酯)、纤维素酶(cellulose R10)、离析酶(macerozyme R10)、水合氯醛、甘油和β–巯基乙醇购自鹏程生物有限公司；其他常规化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

叶片酶解液的配制：参照Yoo 等[12]的方法，按比例分别称取纤维素酶、离析酶、KCl 和甘露醇，加去离子水溶解，然后向其中加入预先于70℃预热5min 的MES，于55℃水浴加热10min 以钝化脱氧核糖核酸酶(DNAse)和蛋白酶(proteases)，增加纤维素酶与离析酶的溶解度。将所配制溶液冷却至室温，加入CaCl2、β–巯基乙醇和BSA，混匀得植物叶片酶解液。所配制酶解液中各组分的浓度分别为纤维素酶1.5%、离析酶0.4%、KCl 20 mmol/L、MES 20 mmol/L、甘露醇 0.4 mol/L、CaCl210 mmol/L、β–巯基乙醇5 mmol/L 和BSA 0.1%，酶解液pH 为5.7。

细胞裂解缓冲液(pH 7.5)的配制：按比例分别称取Tris base、Na2EDTA 、四盐酸精胺、KCl 和NaCl，以去离子水配制细胞裂解缓冲液，并加入TritonX–100 和β–巯基乙醇，使Tris、Na2EDTA、四盐酸精胺、KCl、NaCl、和β–巯基乙醇的浓度分别为15、2、0.5、80、20、15 mmol/L，TritonX–100为0.5%，调节pH 至7.5，于－20℃条件下保存。

磷酸缓冲液(pH7.4)的配制：取7.65g NaCl、0.725g Na2HPO4和0.212g KH2PO4，加入800mL去离子水溶解后调节pH 至7.4，然后定容至1 L。

洗涤溶液I 的配制：按比例分别称取NaCl、CaCl2、KCl 和葡萄糖，以去离子水配制洗涤溶液I，使NaCl、CaCl2、KCl 和葡萄糖的浓度分别为154、125、5、5 mmol/L，加入0.03% MES。

碘化丙啶(PI)染液的配制：用已配制的磷酸缓冲液溶解PI，使其质量浓度为100μg/mL，加入100μg/mL 的RNase 和0.1% 的TritonX–100，配制成碘化丙啶(PI)染液。

1.3 植物的种植与管理

按照Xia 等[11]的方法，将rfc3–1 突变体种子和野生型种子进行消毒后，置于4℃环境中春化3 d，春化后播种在灭菌过的培养土上。待种子发芽，幼苗生长3 d 后揭开培养盘盖，约10 d 后将幼苗移栽到新配制的培养土中，然后再在16 h 光照(23 )/ 8 h℃黑暗(21 )℃ 培养室条件下继续培养4～5 周后取材。

1.4 叶细胞数直接高效检测体系的建立

为了探寻rfc3-1 叶片面积的变化是由叶细胞面积(体积) 变化引起的还是由细胞数变化引起的，需要获取每片叶的全部离散细胞，以便对叶片细胞数进行精确计数，建立植物叶片细胞直接高效检测体系。

1.4.1 植物叶片的酶解

从苗龄约4～5 周生长良好的拟南芥野生型 (Col)植株和rfc3–1 突变体植株中随机选取同等数量的、状态良好的植株。分别剪取植株的第1、2片和第3、4 片真叶，并将第1 片与第2 片真叶、第3 片与第4 片真叶混在一起取样。用刀片将叶片均匀横切成宽约0.1 mm 的窄条，将窄条放入圆底离心管中，加入新配制的酶解液，每2mL 叶片酶解液中加入10 片叶片窄条，立即用锡纸包裹遮光，于22 ℃30～40 r/min 摇床上黑暗酶解12 h，直到所有叶片窄条酶解完全为止。

1.4.2 植物细胞裂解与细胞核的收集

将酶解完全的叶片酶解液用孔径38.5 μm 的钢筛过滤后，于1 500g 离心10min，去上清。加入洗涤溶液I 溶解洗涤沉淀，并用装有500 μL 枪头的移液枪(剪去顶端1～2 cm)吹吸沉淀多次，直至沉淀完全溶解，再于1 500g 离心10min，去上清，留在管底的绿色沉淀即为叶片原生质体。加入含0.5%Triton–100 的预冷细胞裂解缓冲液，再用装有200 μL 枪头的移液枪(剪去顶端1～2 cm)吹吸沉淀多次，直至溶解完全，再冰浴5～10min，使叶片原生质体破裂细胞核释放出来。于4℃条件下1 500g离心10min，去上清，沉淀再次用预冷细胞裂解溶解。重复上述步骤1～3次，直至沉淀为灰黑色。

1.4.3 细胞核的染色与流式细胞仪计数

在上述所得灰黑色沉淀中加入含 0.5% Triton–100 的磷酸缓冲液(pH 7.4)500 μL，用装有200 μL 枪头的移液枪(剪去顶端1～2 cm)吹吸沉淀多次，直至沉淀完全溶解后，加入等体积的PI 染液，混匀，冰浴30min 后用双层孔径为38.5 μm 的尼龙膜过滤，用流式细胞仪检测分析滤液细胞核数，根据每次检测时流式细胞仪吸取样本的体积和叶片滤液的总体积，统计出叶片细胞数。

1.5 原生质体计数板计数与叶表皮细胞计数

为了对比和验证本试验中建立的细胞数直接高效检测体系，对野生型(Col)植株和rfc3–1 突变体植株的叶片样本进行原生质体细胞计数板统计计数和叶表皮细胞统计计数。

每叶细胞数的统计：参照Yoo等[12]的方法，在植物叶片样本酶解完全后，直接取样置于细胞计数板上，显微观察并进行原生质体计数，再根据酶解液的体积粗略统计出每叶的细胞数。

叶表皮细胞计数方法：参照Xia等方法[11]，用水合氯醛、甘油、蒸馏水[13]将叶细胞内含物清除，用Zeiss Axiovert 200M显微镜观察叶片上、下表皮细胞，用Axiocam HRm数码相机显微照相，然后用软件计算叶片表面积和表皮细胞的平均面积，并由此计算出上、下表皮的细胞数。

用数码相机获取叶片图片后用软件计算叶片面积。

2 结果与分析

2.1 野生型(Col)植株和rfc3–1 突变体植株叶片的形态特征

在相同培养条件下，rfc3–1突变体植株在生长早期就显现出与野生型(Col)植株明显的差异特征：株型矮小，叶小而狭长(图1)。

图1 野生型(Col)和rfc3–1 突变体的叶片形态 Fig.1 Leaf morphologyof wild type (Col) and rfc3–1 mutant plants

为量化这种差异特征，本研究中检测并统计了生长约30 d 的野生型(Col) 幼株和rfc3–1突变体幼株第3、4叶的叶柄长、叶片长、叶宽度和叶面积(表1)，发现rfc3–1叶柄长度比野生型的短24.90%，叶片长、宽度分别少21.79% 和 33.24%，而叶片面积只有野生型相应叶片面积的54.66%(P＜0.01)，说明RFC3 基因突变导致叶片面积减少了45.34% (P＜0.01)。

表1 生长约30 d幼株第3、4片叶的形态指标 Table 1 Morphological parameters of the 3rd and the 4th leaf of the about 30d seedlings

2.2 植物细胞数的直接高效检测结果

在不同试验条件下对植物叶片进行酶解的结果表明，在温度为22℃、转速30～40 r/min 摇床上锡纸包裹遮光条件下，黑暗酶解12 h，所有叶片窄条可被完全酶解。

叶片酶解后，去除叶绿体和线粒体等悬浮颗粒杂质(含质粒DNA)，获得灰黑色的细胞核沉淀。通过优化细胞核染色与分析检测参数，得到最佳试验条件。用流式细胞仪检测计数时将仪器参数设置如下：FS 为Volts 77–gain 1；SS 为Volts 66–gain 1；PI 为Volts 851–gain 1；AUX 为Volts 514–gain 5。每次计数时间30 s。野生型(Col)植株和突变体rfc3–1 植株第1、2 片与第3、4 片真叶的细胞核数计数结果的变异值都小于5%，表明有效数据在正常的变异范围内。多次重复的试验结果一致，完全符合检测要求。

图2 野生型(Col) 及rfc3–1 突变体叶片细胞核数的流式细胞仪检测分析结果 Fig.2 Numbers of cell nuclei from leaf in wild type (Col) and rfc3–1 mutant platsgotten by flow cytometry

根据检测结果计算出每片真叶细胞数的结果表明，野生型(Col)植株第1 片与第2 片真叶细胞数的平均值每片叶为4.62×104个，是rfc3–1 突变体植株第1 片与第2 片真叶细胞数(平均每片叶为2.84×104个)的1.6 倍；野生型(Col) 植株第3 片与第4 片真叶细胞数的平均值(每片叶1.14×105个)是rfc3–1 突变体植株第3 片与第4 片真叶细胞数平均值(每片叶4.45×104个)的2.6 倍，表明rfc3–1 突变体叶细胞数大幅度降低，说明RFC3 基因突变削弱了植株细胞分裂的增生能力。

2.3 所建立的检测体系与原生质体计数板计数和叶表皮细胞计数法的比较

原生质体细胞计数板统计结果显示，野生型(Col) 植株第1 片与第2 片真叶细胞数平均每片叶约为5.28×104个，是rfc3–1 突变体植株的第1 片与第2 片真叶细胞数(平均每片叶约为2.77×104个)的1.9 倍；野生型(Col) 植株第3 片与第4 片真叶细胞数的平均值(每片叶约为1.18×105个)是rfc3–1 突变体植株第3 片与第4 片真叶细胞数(平均每片叶约为4.43×104个)的2.6 倍。该结果与本试验所建立的检测体系检测结果基本一致。

图3 野生型(Col)植株和rfc3–1 突变体植株真叶的表皮细胞形态 Fig.3 Morphology of epidermal cell from leaf in wild type (Col) and rfc3–1 mutant plants

用显微镜系统自带软件统计图3 中叶表皮细胞的面积，结果表明rfc3–1 突变体植株真叶的上、下表皮细胞表面积稍大于野生型(Col) 植株相应叶片的上、下表皮细胞表面积。野生型(Col) 植株第3 片真叶上表皮细胞数平均每片叶约6 423个，是rfc3–1 突变体植株第3 片真叶上表皮细胞数平均值(每片叶约2 086个)的3.08 倍；野生型(Col) 植株第3 片真叶下表皮细胞平均数(每片叶约为4 259个)是rfc3–1 突变体植株第3 片真叶下表皮细胞数平均值(每片叶约为1427个)的2.99 倍。结果表明表皮细胞数真实反映出了rfc3–1 突变体叶细胞数的突变特性。

3 结论与讨论

RFC3 基因突变对植物细胞分裂增殖的影响。拟南芥AtRFC1 (RFC 复合物大亚基)在植株花器官发育中有重要作用[11]。AtRFC1 可能在拟南芥基因组稳定性和基因转录沉默(transcriptionalgene silencing，TGS)中起重要作用[14]，还可能在减数分裂过程染色体交叉交换中起重要作用而影响配子体发育[15–16]。Xia 等[9–10]通过EMS 诱变和图位克隆突变体基因，发现在低浓度SA 诱导下，rfc3–1 植株体内抗病蛋白PR1 和PR2 的表达量大幅度上调，对病原菌的抗性显著增强。遮光培养2.5 d 时rfc3–1 黄化苗下胚轴变得更长，这可能是由RFC基因突变，造成 rfc3–1 突变体纯合子植株的黄化幼苗下胚轴表皮细胞长度大于野生型植株的下胚轴表皮细胞长度所致[17–18]。本研究中发现，在相同培养条件下，rfc3–1 突变体植株第3、4 片真叶的叶面积只有野生型的54.66%，较小的叶片面积可能是由更小体积或更少数目的细胞引起。

植物细胞数的检测。为研究RFC3 基因突变对植物细胞分裂增殖的影响，笔者通过叶片酶解、细胞裂解和细胞核收集与染色后，采用流式细胞仪检测分析了RFC3 基因突变对突变体rfc3–1 植株叶片细胞数的影响，建立了植物叶片细胞直接高效检测体系，并获得了CV 值(变异值)皆小于5%的细胞核计数图。近年来，虽然流式细胞仪逐渐被用于对植物染色体倍性进行检测[19]，但尚未有关于植物细胞数检测的报道。本试验中发现，拟南芥野生型(Col) 植株第1、2 片和第3、4 片真叶细胞数平均值分别是rfc3–1 突变体植株相应叶片细胞数平均值的1.6倍和2.6 倍，进一步证明了RFC3 基因突变削弱了植株的细胞分裂增生能力。

以同样样本进行原生质体细胞计数板统计计数得到的结果，与本试验建立的检测体系测定结果基本一致，但数据的标准差稍大。其主要原因是：在取样计数时，若酶解时间过短，将导致细胞分离不完全，粘连体多；若酶解时间过长，原生质体容易破裂，获得完整细胞的比例不高，导致统计误差大。叶表皮细胞统计计数结果也反映出RFC3 基因突变对植株第3 片真叶细胞分裂增殖的显著影响，但只得到表皮细胞的数目或每一横(竖)切面上细胞的数目，而难以对整个叶片细胞进行计数，且需要长时间的显微镜和专业软件操作。与之相比，本试验中建立的检测体系可更直接、客观、精确地检测拟南芥叶片细胞数，且操作时间较短，操作方便，重复性好。

综合分析结果表明，拟兰芥野生型植株第1、2片真叶的细胞数平均值是rfc3–1 相应叶片细胞数平均值的1.6 倍，第3、4 片真叶的细胞数平均值是rfc3–1 的2.6 倍，表明RFC3 基因突变严重影响了植物细胞分裂增殖，导致rfc3–1 叶片细胞数大幅减少。本试验体系获得的细胞(核)计数的变异值(CV值)皆小于5%，与原生质体细胞板计数或叶表皮细胞计数相比，具有高效、精确和重现性好的优势。

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