B族链球菌核酸检测在产前筛查中的应用

黄满辉张龙绘李珍宇.广东省东莞市清溪医院妇产科，广东东莞 53660；.广东省东莞市清溪医院检验科，广东东莞 53660

B族链球菌核酸检测在产前筛查中的应用

黄满辉1张龙绘1李珍宇2
1.广东省东莞市清溪医院妇产科，广东东莞 523660；2.广东省东莞市清溪医院检验科，广东东莞 523660

[摘要]目的 探讨B族链球菌核酸检测在产前筛查中的应用价值。 方法 选择2012年7月～2014年6月在我院产科门诊进行常规产检、单胎宫内妊娠、胎儿存活的325例孕妇为研究对象，于孕35～37周取阴道分泌物和肛周分泌物，分别进行细菌培养与实时PCR检测，观察两种检测方法检出效果，比较B族链球菌阳性、阴性对孕产妇妊娠结局及对新生儿结局的影响。 结果 325例孕妇中，B族链球菌细菌培养检出阳性13例（4%），实时PCR检测检出阳性29例（8.92%），特异度为94.9%，灵敏度为100.0%，阳性预测值为44.8%，阴性预测值为100.0%；B族链球菌阳性孕产妇宫内感染（13.79%）、胎膜早破（34.48%）、早产（10.34%）、产后出血（10.34%）均明显高于GBS阴性孕产妇（P＜0.05）；B族链球菌阳性孕产妇所分娩新生儿肺炎（6.9%）、新生儿败血症（6.9%）、新生儿窘迫（13.79%）明显高于GBS阴性所分娩新生儿（P＜0.05）。 结论妊娠晚期B族链球菌携带明显增加了孕产妇宫内感染、胎膜早破、早产、产后出血以及新生儿肺炎、新生儿败血症、新生儿窘迫发生率，B组链球菌核酸检测试验用于产前检查有着重要的意义。

[关键词]B族链球菌；实时PCR检测；妊娠结局；新生儿结局

B族链球菌学名无乳链球菌，是一种革兰阳性球菌，常寄生于阴道和直肠，是围产期感染中排在首位的致病菌[1]，可导致严重的新生儿感染，也是孕产妇生殖道感染的重要病菌，易诱发泌尿道感染、产褥感染以及孕产妇败血症、早产，同时也易诱发新生儿脑膜炎、肺炎、败血症。美国疾病控制中心（CDC）报道平均每年约为8000例新生儿感染B族链球菌，病死率约为5%，为此制定了B族链球菌筛查和处理指南[2-3]，极大降低了围产期B族链球菌的发生率。我国有关B族球菌感染的研究较少，少有的报道也提示B族链球菌可能是新生儿肺炎死亡的第一位致病菌[4]。传统的检测方法是标准细菌培养，至少需要24 ～ 48h才能完成，实时PCR检测整个操作过程只需2～4h，能很好地满足临产前检测的需要[5]。本文选择325例孕妇为研究对象，分别采用细菌培养与实时PCR检测的方法，探讨实时PCR检测的应用价值以B族链球菌感染对孕产妇和新生儿结局的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年7月～2014年6月在我院产科门诊进行常规产检、单胎宫内妊娠、胎儿存活的325例孕妇为研究对象，年龄20～35岁，平均（26.5±3.1）岁，其中经产妇20例，初产妇305例；孕周32～41周，平均孕周（36.35±4.25）周。所有孕妇近期均无性交以及使用抗生素史，并全部签署知情同意书。

1.2 方法

参照2002年美国疾病控制中心（CDC）推荐取材方法[6]，于孕35～37周期间对孕妇取材，先用2根消毒棉拭子置入阴道下1/3内取阴道分泌物，再用2根消毒棉拭子插入肛门取直肠分泌物，分别用于细菌培养和实时PCR检测。

1.2.1 细菌培养 取阴道、直肠分泌物放入5%羊血培养基内，温度控制35℃，培养18～24h，取灰白、圆形可疑菌（革兰氏染色阳性链球菌、触酶实验阴性）接种培养16h，使用法国生物梅里埃VITEK-2细菌鉴定仪进行鉴定。

1.2.2 实时PCR检测 取阴道、直肠分泌物棉拭子置入1mL无菌清洗液中，室温下保存，24h检测。震荡均匀，并充分挤干棉拭子，将全部液体吸入1.5mL离心管内，13000r/min，离心分离5min，弃除上清液，加50μL三羟基氨基甲烷-已二胺四乙酸缓冲液重悬，加入10μL内参照，加入提取固形物震荡5min，离心后95℃加热2min后，立即冰浴5min，高速（13000r/min）离心1min，取上清液进行PCR扩增检测。对于实时PCR与细菌培养检测相异标本，采用第2对引物进行二次扩增测序的方法进行校正。实时PCR检测试剂选用福建泰普生物科技有限公司生产的试剂。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0对数据进行统计分析，计数资料用频数（n）或率（%）表示，采用x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 325例孕妇B族链球菌细菌培养与实时PCR检测分析

以细菌培养结果作为金标准进行PCR检测结果对比。对比结果显示，325例孕妇中，B族链球菌细菌培养检出阳性13例（4%，13/325），实时PCR检测检出阳性29例（8.92%，29/325）。13例细菌培养检出阳性中，实时PCR检测均为阳性；另外16例细菌培养阴性患者，进行扩增测序及结合临床进展结果显示，14例为B族链球菌阳性，2例阴性。特异度为94.9%，灵敏度为100.0%，阳性预测值为44.8%，阴性预测值为100.0%。见表1。

表1　325例样本细菌培养与实时PCR检测结果比较

表2　B族链球菌阳性与阴性孕产妇的妊娠结局比较[n（%）]

表3　B族链球菌阳性与阴性新生儿结局比较[n（%）]

2.2 B族链球菌阳性对孕妇妊娠结局的影响

B族链球菌阳性患者分娩方式与阴性患者比较差异无统计学意义；GBS阳性孕产妇宫内感染（13.79%）、胎膜早破（34.48%）、早产（10.34%）、产后出血（10.34%） 均明显高于GBS阴性孕产妇（P＜0.05）。见表2。

2.3 B族链球菌阳性对新生儿结局的影响

GBS阳性与阴性孕产妇所分娩新生儿上呼吸道感染比较差异无统计学意义；GBS阳性孕产妇所分娩新生儿发生新生儿肺炎（6.9%）、新生儿败血症（6.9%）、新生儿窘迫（13.79%）明显高于GBS阴性所分娩新生儿（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

B族链球菌是一种寄生于泌尿生殖道及消化道的致病菌，不同地区、不同种族妊娠晚期妇女带菌率各有不同。1996年美国疾病控制中心（CDC）提出的预防和控制B族链球菌方案得到了美国儿科学会（AAP）、美国妇产科学会（ACOG）的认可[7]，明确提高对所有孕周为35～37周的孕妇进行B族链球菌培养，对检出阳性患者进行预防性治疗，据统计，这种预防和控制方案可以对26.7%的分娩者进行预防性治疗，能够预防86%的新生儿发生B族链球菌感染[8]。B族链球菌是围生期最重要的致病菌之一，能够上行感染胎膜。有文献研究显示[9]，在众多围生期病原菌中，GBS对于绒毛膜的吸附能力和穿透能力最强，不但会引起细胞因子及前列腺素的释放，同时还会造成磷脂酶A2的升高，引发胎膜张力降低、组织水肿，从而造成胎膜早破及刺激宫缩引起早产。

胎膜早破的产妇往往合并有羊膜腔感染，但这在早期并无明显症状，病理学上诊断为绒毛膜羊膜炎，属于亚临床感染，如果能及时控制，则能够有效阻断感染的发展，改善妊娠结局。传统的细菌培养与鉴定时间较长，大约需要24～48h，由于B族链球菌具有间歇性与短暂性的特点，而且免疫学的敏感性与B族链球菌含量有关，常规35～37孕周链球菌培养筛查方法漏诊率较大，黄永建等[9]通过对445例妊娠晚期妇女B族链球菌细菌培养与实时PCR检测方法的比较研究，证实实时PCR检测方法阳性率明显高于细菌培养阳性率。本文研究结果表明，325例受检孕妇中，B族链球菌细菌培养阳性检出率4%（13/325），实时PCR阳性检出率8.92%（29/325），通过对细菌培养与实时PCR检出相异16例扩增测序检测，14例显示阳性，2例阴性，实时PCR敏感度100.0%（26/26），特异度99.38% （323/325），提示实时PCR检测具有快速、准确、灵敏、特异的特点，显示出更高的实用性和优越性。从本次结果来看，荧光实时PCR的敏感性及特异性均较高，符合临床检验需求，但也有学者研究[10]指出，实时PCR检验费用较高是影响该方案普及的一个重要因素，也是影响产前筛查大范围推广的一个阻碍，而细菌培养则检验周期更长，两者各有优劣，可根据具体情况而定。

B族链球菌是广泛种植于泌尿生殖道，而且与宿主严重感染性疾病密切相关，研究表明，如果在宫颈中发现大量B族链球菌，可诱发胎膜早破、早产、败血症等妊娠并发症，感染是胎膜早破的主要危险因素，B族链球菌对绒毛膜的穿透力和吸附力最强，王兆莉等[10]研究表明，B族链球菌阳性孕妇产妇胎膜早破发生率32.00%（8/25）明显高于B族链球菌阴性患者19.27%（53/275）。既往研究表明，B族链球菌感染是导致早产的重要原因之一[11]，孕妇发生B族链球菌感染后，将释放前列腺素、磷酯酶A、肿瘤坏死因子（TNF）以及白细胞介素IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等，从而刺激子宫收缩导致早产。本文研究中，GBS阳性孕产妇宫内感染、胎膜早破、早产、产后出血均明显高于GBS阴性孕产妇，提示GBS感染可能与孕妇妊娠结局有一定的相关性。

近20年来，B族链球菌已成为世界各国新生儿感染性疾病的主要病原菌，B族链球菌引起新生儿最常见的病变为新生儿脓毒血症，早发性B族链球菌感染极易诱发新生儿败血症、肺炎、脑膜炎，晚发性感染一般于产后一周甚至10d后开始发病[12-14]，有学者[15-16]通过对234例死亡新生儿肺组织B族链球菌检测，报道B族链球菌阳性检出率65%，认为B族链球菌是导致新生儿肺炎死亡的主要至致病菌。本文研究中，实时PCR检出29例GBS阳性孕产妇所分娩新生儿中，发生新生儿肺炎、新生儿败血症、新生儿窘迫比例明显高于CBS阴性孕产妇所分娩新生儿。从这一点来看，重视产前筛查结果，能够有效的避免新生儿疾病的发生，或做好预防措施，提前治疗，改善新生儿预后。但总体来说，国内产前筛查的推广尚有欠缺，普及程度较低，这也是导致新生儿疾病发生率高的主要因素。因此建议相关部门加强该方面的宣教，在社区等地方做好推广，提高产前筛查率，实现优生优育。

综上所述，实时PCR检测方法检测B族链球菌具有快速、准确、灵敏、特异的特点，可能成为B族链球菌检测的常规方法；B族链球菌阳性可明显增加孕产妇宫内感染、胎膜早破、早产、产后出血发生率，也导致新生儿肺炎、新生儿败血症、新生儿窘迫发生率的增加，应引起足够的重视。

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Application on nucleic acid detection of group B streptococcus in prenatal screening

HUANG Manhui1ZHANG Longhui1LI Zhenyu2
1.Department of Gynecology and Obstetrics, Qingxi Hospital of Dongguan City, Guangdong, Dongguan 523660, China; 2.Department of Laboratory, Qingxi Hospital of Dongguan City, Guangdong, Dongguan 523660, China

[Abstract]Objective To study the application value on the nucleic acid detection of group B streptococcus in prenatal screening. Methods 325 pregnant women with single pregnancy intrauterine pregnancy and surviving fetus, who were carried on routine antenatal examination in obstetrical outpationt department of our hospital from July 2012 to June 2014, were selected as the research objects. To respectively carry on the bacterial culture and real-time PCR detection on the vaginal secretion and perianal secretion at 35-37 gestational weeks, to observe the detection effect between the two detection methods, to compare the effect of group B positive and negative streptococcus on the pregnancy outcome of pregnant women and neonatal outcome. Results Of the 325 pregnant women, the positive detection of bacterial culture in group B streptococcus were 13 cases（4%）, and the positive detection of realtime PCR detection were 29 cases（8.92%）, with the specificity of 94.9%, the sensitivity of 100.0%, the positive predictive value of 44.8%, and the negative predictive value of 100.0%. The intrauterine infection, the premature rupture of membranes, the premature delivery, and the postpartum hemorrhage in pregnant women with positive GBS(13.79%, 34.48%, 10.34%, 10.34%) were obviously higher than which in pregnant women with negative GBS (P＜0.05). Conclusion Group B streptococcus carried in late pregnancy have obviously increased the incidence of the intrauterine infection, premature rupture of membranes, premature delivery, postpartum hemorrhage, neonatal pneumonia, neonatal septicemia, and neonatal strccs in pregnant women. The application of nucleic acid detection of group B streptococcus in prenatal screening has important significance.

[Key words]Group B streptococcus; Real-time PCR detection; Pregnancy outcome; Neonatal outcome

[中图分类号]R714.7

[文献标识码]B

[文章编号]2095-0616（2015）24- 81-04

[基金项目]广东省东莞市科技计划医疗卫生类科研一般项目（201210515000538）。

收稿日期：（2015-10-26）