单一和复配微生物固态发酵对卷烟叶组主要化学成分的影响

王颖，马玲玲，吕欣*，赵德学，黄仲波

1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西省咸阳市杨凌区西农路28号 712100

2.陕西中烟工业有限责任公司，西安市雁塔区沣惠南路38号 710065

单一和复配微生物固态发酵对卷烟叶组主要化学成分的影响

王颖*1,2，马玲玲*1，吕欣**1，赵德学2，黄仲波2

1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西省咸阳市杨凌区西农路28号 712100

2.陕西中烟工业有限责任公司，西安市雁塔区沣惠南路38号 710065

为研究单一菌株和复配菌株对卷烟叶组化学成分的影响，考察了固态发酵过程中3株微生物（酵母菌LBT1.0038，芽孢杆菌LBT1.0007和LBT1.0013）对卷烟叶组碳水化合物、含氮化合物、有机酸、氨基酸和石油醚提取物等主要化学成分的影响。结果表明：与对照叶组相比，用单一菌株和复配菌株发酵时，叶组的淀粉含量（质量分数，下同）均显著下降，且水溶性糖总量也呈下降趋势；叶组的总氮含量变化不显著，可溶性蛋白质含量下降，氨基酸总量升高。用单一菌株或低施加量复配菌株发酵时，叶组有机酸总量升高。用复配菌株发酵时，叶组的石油醚提取物含量显著增加。单一和复配菌株均对叶组主要化学成分有影响，但复配菌株对叶组化学成分的影响不呈现叠加效应，其中芽孢杆菌在降解蛋白质和淀粉等方面起主要作用，而酵母菌对叶组总氮和石油醚提取物有显著影响。

微生物；菌株；卷烟叶组；固态发酵；化学成分

烟叶表面微生物数量庞大、种类繁多，它们在烟叶发酵过程中起到重要作用［1］。将微生物及其制剂作用于烟叶表面，可缩短发酵时间、提高烟叶香味物质含量、改善烟叶香气和吸味［2-4］，这是由于微生物作用于烟叶表面后，将烟叶中大分子物质降解为单糖、氨基酸和有机酸等多种小分子成分，这些小分子再进一步反应或者降解为醇、醛、酸、酯等致香成分，从而改善烟叶吸食品质［5］。同时，将微生物应用于烟叶醇化，还可以降低卷烟烟气中有害成分的释放量［6］。近年来，将从烟叶表面分离的微生物菌株应用于烟叶发酵已经成为国内外研究的热点之一［7］。在前期研究中，考察了单一菌株对烟叶品质的影响［8-9］，并建立了基于微生物固态发酵的卷烟生产工艺［10-12］，结果表明，通过分离烟叶表面的微生物并将其用于卷烟叶组固态发酵，可以开发具有特定感官风格及更低烟气有害成分释放量的卷烟新产品。目前复配菌株及单一菌株对叶组主要化学成分的影响尚不清楚，因此，考察了上述卷烟叶组发酵过程中，单一菌株和复配菌株对叶组主要化学成分的影响，旨在为研究微生物固态发酵对改善卷烟叶组吸食品质的影响提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

“好猫（天赋）”牌卷烟叶组（陕西中烟工业有限责任公司提供）；菌株：酵母菌（Saccharomyces sp.）LBT1.0038，芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0007和芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0013；复配菌株：由上述单一菌株按1∶1∶1比例复配制成。

硼酸、氢氧化钠、柠檬酸钠、硫酸钾、五水硫酸铜（AR），浓硫酸（GR）（广东光华科技股份有限公司）；二氯甲烷（HPLC级，天津市科密欧化学试剂有限公司）；石油醚（沸程30～60℃，AR，天津博迪化工股份有限公司）；蔗糖、葡萄糖、柠檬酸、琥珀酸（99.5%，质量分数，下同），果糖、草酸（99%），苹果酸、乳酸（98%），直链淀粉、支链淀粉（100%）（美国Sigma公司）；去离子水（自制）。

L-8900全自动氨基酸分析仪（日本Hitachi公司）；721可见光分光光度计（上海精密科学仪器有有限公司）；KjeltecTM8400全自动凯氏定氮仪（瑞典FOSS公司）；Waters 1525高效液相色谱仪（美国Waters公司）；索氏提取装置（自制）；AL104电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 卷烟叶组的固态发酵

采用文献［10］的方法进行卷烟叶组的固态发酵。其中复配菌株的制备如下：将单一菌株的菌悬液按1∶1∶1比例混合，离心并弃去上清液后得到湿菌体，再用5 mL无菌去离子水重悬后即得复配菌株。将所得重悬菌体均匀喷施于烟叶表面进行发酵。对照样品为喷施等量无菌去离子水的叶组，其余各试验叶组所喷施微生物如表1所示。低温烘丝后，将叶组粉碎后过0.42 mm（40目）筛，于24℃、相对湿度65%的恒温恒湿培养箱中平衡24 h。

表1 试验编号及说明①

1.2.2 卷烟叶组主要化学成分的测定

采用流动分析法测定淀粉和总氮［13-14］，液相色谱法测定水溶性糖蔗糖、葡萄糖和果糖［15］，考马斯亮蓝G250比色法测定可溶性蛋白质［16］，氨基酸分析仪法测定氨基酸［17］，高效液相色谱法测定有机酸［18］，分别采用文献［19-20］的方法测定总植物碱、总挥发碱以及石油醚提取物。

1.2.3 数据处理

卷烟叶组的化学指标均重复测定3次，计算其平均值和标准差，并用SPSS软件进行方差分析，采用Duncan新复极差法进行多重比较以研究不同指标下各组处理之间的差异显著性。

2 结果与讨论

2.1 卷烟叶组糖分的变化

通常，淀粉含量过高会导致烟草的吸食品质下降［5,21］，因而淀粉含量降低有助于改善卷烟叶组的感官品质。发酵后卷烟叶组中淀粉和可溶性糖的含量（表2）表明：①与对照叶组（JC00）相比，单一菌株和复配菌株均使卷烟叶组的淀粉含量显著降低。②单一菌株和复配菌株对叶组中淀粉的降解能力不同，喷施单一菌株后叶组淀粉的降解量最高可达16.6%（JC12），而喷施复配菌株后叶组淀粉的降解量最高为13.0%（JC01）。说明在复配条件下，菌株对叶组中淀粉的降解能力并未叠加，而是由于微生物的竞争性生长，复配菌株对淀粉的降解能力有所降低。

对水溶性糖而言，与对照相比，除试验组JC01外，其余各试验组的蔗糖含量均较对照叶组有显著降低；对于葡萄糖而言，单一菌株比复配菌株的降低效果明显；果糖含量均显著降低，且不同菌株处理间差异明显。水溶性糖含量的变化趋势与淀粉的变化趋势类似，即单一菌株作用下叶组蔗糖、葡萄糖和果糖含量的降幅均高于复配菌株。一般而言，微生物分解淀粉产生葡萄糖，而后进入糖代谢途径。由于蔗糖、葡萄糖和果糖都是易被微生物利用的碳源，3种微生物能够代谢这些水溶性糖，因而喷施菌株后叶组中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量呈下降趋势。此外，对叶组而言，糖类与氨基酸的棕色化反应也会导致水溶性糖含量降低。

2.2 卷烟叶组含氮化合物的变化

2.2.1 总氮、可溶性蛋白质、总植物碱和总挥发碱发酵后卷烟叶组的总氮、可溶性蛋白质、总植物碱和总挥发碱如表3所示。由表3可知，用单一菌株和复配菌株（JC01）发酵时，卷烟叶组总氮含量显著升高，但复配菌株的施加量较小（JC02）时，与对照叶组之间差异不显著。用芽孢杆菌发酵（JC11和JC12）后卷烟叶组总氮含量增幅略低于酵母菌发酵（JC10）。用复配菌株对卷烟叶组进行发酵时，较大施加量试验组（JC01）叶组的总氮含量增幅显著高于较小施加量试验组（JC02），表明叶组总氮含量的升高与复配菌株的施加量密切相关。单一酵母菌试验组（JC10）与复配菌株试验组（JC01）叶组总氮含量之间差异不显著，表明酵母菌在使叶组总氮升高的过程中起主导作用。一般而言，在烟叶发酵过程中，其总氮含量会下降［22-24］，但本研究中总氮含量有所升高，这与所用菌株及施加量密切相关［25-26］，也与文献［9］中的研究结果一致。

表2 卷烟叶组淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量①（mg·g-1）

表3 卷烟叶组含氮化合物含量

两种芽孢杆菌菌株（JC11和JC12）均使叶组可溶性蛋白质显著降低，最大可降解3.47%的蛋白质（JC11），两株芽孢杆菌降解叶组蛋白质的能力无明显差异。酵母菌（JC10）不能降解叶组的可溶性蛋白质，反而使其略有上升。用复配菌株发酵后，叶组可溶性蛋白质显著降低，且复配菌株施加量越大，可溶性蛋白质的降解量也越大，最大可达3.83%（JC01）。综上可知，两株芽孢杆菌在降解叶组可溶性蛋白质方面起关键作用。一般而言，蛋白质含量过高是导致烟草品质下降的主要原因之一［5］，因而降低叶组蛋白质含量可使卷烟的感官品质得到改善。

植物碱是植物的代谢产物，常以无机酸或有机酸盐形式存在，与烟气感官品质密切相关，其主要成分烟碱的含量与感官指标烟气浓度显著正相关［26］。由表3可知，与对照叶组相比，用两株芽孢杆菌发酵（JC11和JC12）后，叶组总植物碱含量均显著升高，而用酵母菌发酵（JC10）后，叶组总植物碱含量与对照叶组的差异不显著。用复配菌株发酵时，在施加量较小（JC02）条件下，叶组总植物碱含量升高，而在施加量较大（JC01）条件下，叶组总植物碱含量与对照叶组无明显差异，但复配菌株施加量较小时，叶组的总植物碱含量升高。对总挥发碱而言，单一菌株和复配菌株发酵均使其含量升高，且在单一菌株作用下，总挥发碱含量的增幅略高于复配菌株；复配菌株的施加量越大，总挥发碱含量增幅也越大。

2.2.2 氨基酸

发酵后卷烟叶组的氨基酸含量如表4所示。由表4可知，与对照叶组相比，用单一菌株和复配菌株发酵后，微生物分解可溶性蛋白质（表3），使氨基酸总量有不同程度上升，仅LBT1.0013菌株发酵（JC12）后氨基酸总量略有下降。其中，脯氨酸含量最高，占氨基酸总量的85%左右。在微生物分解蛋白质产生的氨基酸中，一部分会供给其生长繁殖的需要。对于叶组而言，分解产生的氨基酸可与还原糖形成棕色化反应产物，从而有利于叶组感官品质的改善。此外，氨基酸还参与烟草中糖类等物质的代谢过程，生成多种化合物（包括生物碱）的前体物。

表4 卷烟叶组氨基酸含量（mg·g-1）

2.3 卷烟叶组有机酸含量的变化

发酵后卷烟叶组的草酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸含量如表5所示。由表5可知，与对照叶组相比：①用芽孢杆菌发酵（JC11和JC12）后，叶组草酸含量显著升高，而用酵母菌发酵（JC10）后，叶组草酸含量与对照叶组差异不显著；用复配菌株发酵后，叶组草酸含量显著降低，且施加量越大，降幅越大。②单一菌株使叶组苹果酸含量显著升高，但复配菌株使叶组苹果酸含量下降，且随着复配菌株施加量的降低苹果酸含量降幅增大。③用单一菌株发酵后，叶组柠檬酸含量显著升高，但用复配菌株发酵后，柠檬酸含量在菌株施加量较大（JC01）时降低，在菌株施加量较小时（JC02）升高。④用单一菌株发酵后，叶组琥珀酸含量降低，而用复配菌株发酵后，琥珀酸含量的变化与柠檬酸类似，即在菌株施加量较大（JC01）时降低，施加量较小（JC02）时升高。⑤叶组乳酸含量在单一菌株作用下显著升高，用复配菌株发酵时，在菌株施加量较大时（JC01）乳酸含量降低，施加量较小（JC02）时则显著升高。综合来看，单一菌株使叶组有机酸总量升高，而复配菌株在施加量较大（JC01）时使叶组有机酸总量降低，在施加量较小（JC02）时使其显著升高。可见，单一菌株代谢产生有机酸使叶组中有机酸含量升高，而用复配菌株发酵时，叶组有机酸的变化与施加量密切相关。

表5 发酵后卷烟叶组有机酸含量（mg·g-1）

有机酸及其衍生物是烟草中主要香味成分之一，直接影响烟草及其制品的感官品质。非挥发性酸可以调节烟气pH，改善吸味使其变得醇和，还可以改善烟气浓度。苹果酸与烟叶品质正相关，可以增加烟气酸性，改进烟气特征，使烟气吸味平和。草酸和柠檬酸含量一般与烟叶品质负相关，柠檬酸含量较高时烤烟吸味变差［27］。用复配菌株发酵（JC01）后，叶组草酸、柠檬酸和琥珀酸含量显著降低，而苹果酸和乳酸含量变化不显著，总体上降低了对烟草吸味有不利影响的有机酸含量，有利于改善叶组的感官品质。

2.4 卷烟叶组石油醚提取物含量的变化

烟草石油醚提取物与烟草香气量有关，是影响烤烟感官品质的重要因素之一，其含量较高时烟草外观和吸味均较好。烟草石油醚提取物中主要成分为芳香油、树脂、色素、醛、蜡质、游离脂肪酸、脂肪和精油等，这些物质是烟草香气的重要来源，有些是香气的前体物质，有些能够直接进入烟气［28］。发酵后卷烟叶组的石油醚提取物含量如表6所示。

由表6可知，用芽孢杆菌LBT1.0007（JC11）和LBT1.0013（JC12）发酵对叶组石油醚提取物含量的增加没有贡献，甚至会使其含量降低（JC11）；但酵母菌LBT1.0038（JC10）则表现出较强的生香作用，可以明显增加叶组石油醚提取物含量。在复配菌株施加量较大的情况下，叶组石油醚提取物含量显著升高，表明随着复配菌株施加量的增大，发酵后叶组中香气物质的生成量也增大，从而使叶组的吸食品质得到明显改善。

表6 发酵后卷烟叶组石油醚提取物含量

3 结论

在前期研究的基础上，探讨了单一菌株、复配菌株和不同复配菌株施加量对“好猫（天赋）”卷烟叶组主要化学成分的影响，结果表明：单一菌株对叶组各化学成分的影响与菌株有密切关系，芽孢杆菌在降解淀粉和蛋白质方面起关键作用，而酵母菌对总氮和石油醚提取物的贡献更大。当菌株复配后，并未呈现单一菌株对叶组化学成分影响的叠加效应，相反，在草酸等有机酸的变化上甚至呈现出完全相反的趋势。复配菌株的施加量不同时，其对叶组化学成分的影响也存在显著差异。可见，单一微生物和复配的微生物对卷烟叶组化学成分的影响十分复杂，需要进一步研究。

［1］ZHAO Mingqin，WANG Baoxing，LI Fuxin，et al. Analysis of bacterial communities on aging flue-cured tobacco leaves by 16S rDNA PCR-DGGE technology［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，73（6）：1435-1440.

［2］吕欣.烟草微生物生物技术思考［J］.陕西农业科学，2013（6）：129-131，186.

［3］孙玉宇.烟草发酵中微生物研究进展［J］.现代农业科技，2014（9）：302-303，306.

［4］黄静文，焰青，者为，等.短小芽孢杆菌改善烟叶品质的研究［J］.烟草科技，2010（8）：61-64.

［5］谢剑平.烟草与烟气化学成分［M］.北京：化学工业出版社，2011.

［6］颜克亮，武怡，曾晓鹰，等.基于提质减害的烟叶醇化技术研究进展［J］.湖北农业科学，2011，50（3）：450-453.

［7］于会喜，王毅，马永凯，等.发酵烟叶表面微生物的多样性及其应用现状［J］.河北农业科学，2009，13（10）：59-60，70.

［8］吕欣，赵德学，王颖，等.一种用于烤烟快速增香的微生物菌株及烟叶发酵的应用：中国，102505002B［P］.2013-01-23.

［9］吕欣，王颖，赵德学，等.增香微生物用于烤烟发酵的初步研究［J］.西北农林科技大学学报：自然科学版，2011，39（12）：186-190，195.

［10］吕欣，王颖，赵德学，等.固态发酵法好猫“天赋”卷烟的研制［J］.陕西农业科学，2013（2）：9-12，76.

［11］吕欣，赵德学，王颖，等.一组卷烟赋香菌株及复配的微生物制剂及其应用：中国，102399725B［P］. 2013-04-04.

［12］吕欣，赵德学，王颖，等.采用赋香复合微生物制剂的无添加剂卷烟生产工艺：中国，102499438B［P］. 2013-01-02.

［13］YC/T 216—2007烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法［S］.

［14］YC/T 161—2002烟草及烟草制品总氮的测定连续流动法［S］.

［15］苏轶，江安庆，逯平杰，等.超声辅助萃取HPLC法测定烟草中蔗糖、果糖、葡萄糖含量［J］.安徽农业科学，2011，39（24）：14988-14989，14992.

［16］段伶俐.烘烤过程中烟叶蛋白质含量的动态变化［J］.湖南烟草，2010（2）：32-34.

［17］YC/T 282—2009烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪法［S］.

［18］尹莉丽，赵百东，杨虹琦，等.高效液相色谱法测定烤烟非挥发性有机酸含量［J］.湖南农业大学学报：自然科学版，2014，40（2）：139-143.

［19］GB/T 23225—2008烟草及烟草制品总植物碱的测定光度法［S］.

［20］李春丽，毛绍春.烟叶化学成分及其分析［M］.昆明：云南大学出版社，2007.

［21］许建营.烟草工艺与调香技术［M］.北京：中国纺织出版社，2007.

［22］席元肖，魏春阳，宋纪真，等.不同香型烤烟化学成分含量的差异［J］.烟草科技，2011（5）：29-33，65.

［23］赵铭钦.烤烟陈化的生理生化机制与叶面优势微生物的分离筛选及增香效应［D］.郑州：河南农业大学，2009.

［24］张明清，张瀛，林建麒，等.不同品种初烤烟叶短期醇化过程中质体色素和化学成分的变化［J］.中国烟草科学，2014，35（2）：55-58.

［25］廖飞.烟叶增香微生物优异菌株及诱香配套技术研究［D］.福州：福建农林大学，2010.

［26］史宏志，邸慧慧，赵晓丹，等.豫中烤烟烟碱和总氮含量与中性香气成分含量的关系［J］.作物学报，2009，35（7）：1299-1305.

［27］杜咏梅，张怀宝，付秋娟，等.烤烟非挥发有机酸、高级脂肪酸与其他成分及其感官品质的关系［J］.烟草科技，2011（6）：29-34.

［28］祁林，陈伟，王政，等.浓香型烟叶不同分切区位石油醚提取物的含量［J］.烟草科技，2014（1）：53-55，76.

责任编辑 洪广峰

Effects of Single and Mixed Culture Solid State Fermentation on Main Chemical Components in Cigarette Blend

WANG Ying*1,2,MA Lingling*1,LÜ Xin**1,ZHAO Dexue2,and HUANG Zhongbo2
1.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,Shaanxi,China
2.China Tobacco Shaanxi Industrial Co.,Ltd.,Xi’an 710065,China

In order to study the effects of single bacterium strain and mixed strains on the chemical components in a cigarette blend,the influences of three strains（Saccharomyces sp.LBT1.0038,Bacillus sp. LBT1.0007 and LBT1.0003）on the carbohydrates,nitrogenous compounds,organic acids,amino acids and petroleum ether extract in a cigarette blend during solid state fermentation were investigated.The results showed that:comparing with the control,the content of starch in a cigarette blend significantly decreased and that of total water soluble sugar decreased;total nitrogen content did not change significantly,while protein content decreased and total content of amino acids increased after fermentation with single strain or mixed strains.The total content of organic acids in a cigarette blend increased after fermentation with single strain or mixed strains at a low application rate.The content of petroleum ether extract increasedsignificantly after fermentation with mixed strains.Both single and mixed strains affected the main chemical components in a cigarette blend,however,mixed strains did not present additive effects.Bacillus played an important role in the degradation of starch and protein,while Saccharomyces imparted significant effects on the total nitrogen and petroleum ether extract.

Microorganism；Strain；Cigarette blend；Solid state fermentation；Chemical component

TS444

A

1002-0861（2015）11-0047-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151109

2014-10-09

2015-06-26

陕西中烟工业有限责任公司重点项目“烟叶生物发酵增香技术研究及工业化应用”（No.047）。

王颖（1986—），女，硕士，助理工程师，主要从事烟草微生物生物技术研究。E-mail:ying45855117@163.com；*共同第一作者：马玲玲（1986—），女，在读硕士研究生，研究方向:烟草微生物生物技术。E-mail:345429831@qq. com；**

吕欣，E-mail:xinlu@nwsuaf.edu.cn

王颖，马玲玲，吕欣，等.单一和复配微生物固态发酵对卷烟叶组主要化学成分的影响［J］.烟草科技，2015，48（11）：47-52.

WANG Ying，MA Lingling，LÜ Xin，et al.Effects of single and mixed culture solid state fermentation on main chemical components in cigarette blend［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：47-52.