喀斯特山区不同种植方式下烟田土壤微生物特征分析

黄化刚，肖谋良，梁士楚，张龙，肖和友，代园凤，申燕*，苏以荣，陈香碧

1.贵州省烟草公司毕节市公司，贵州省毕节市天河路116号 551700

2.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，长沙市芙蓉区远大二路644号 410125

3.广西师范大学生命科学学院，广西壮族自治区桂林市七星区育才路15号 541004

喀斯特山区不同种植方式下烟田土壤微生物特征分析

黄化刚1，肖谋良2，3，梁士楚3，张龙1，肖和友2，代园凤1，申燕*1，苏以荣2，陈香碧2

1.贵州省烟草公司毕节市公司，贵州省毕节市天河路116号 551700

2.中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室，长沙市芙蓉区远大二路644号 410125

3.广西师范大学生命科学学院，广西壮族自治区桂林市七星区育才路15号 541004

为明确喀斯特山区烤烟由常规种植转为有机种植方式后烟田土壤微生物特征的变化，在贵州省金沙县以常规种植方式为对照，选择连续3年进行有机种植的烟田为试验对象，研究了两种种植方式下烟田土壤基本性质、细菌和真菌群落结构特征及其关键影响因素。结果表明，喀斯特山区烤烟种植方式由常规种植转换为有机种植后，土壤有机质、微生物生物量碳显著增加，而全氮、全钾、速效磷、速效钾等养分含量（质量分数）显著降低（p＜0.05）；两种种植方式下，土壤微生物丰富度和多样性均以细菌高于真菌，土壤细菌和真菌多样性以及在“门”分类上的群落结构差异不大，细菌以变形菌门、放线菌门、酸杆菌门占优势（54.2%～62.0%），真菌以子囊菌门占绝对优势（74.4%）；常规种植转为有机种植方式后，烟田土壤有益微生物类群数量增加。喀斯特山区烟田土壤微生物群落结构主要受土壤有机质、养分和容重的影响。

喀斯特山区；烤烟；有机种植；常规种植；土壤微生物；细菌；真菌

贵州有机烟叶产业配套发展模式主要有“有机高粱—有机烟叶”和“有机水稻—有机烟叶”两种。该模式参照有机农业生产标准，在烤烟种植过程中禁止使用化学合成农药、生长调节剂等物质，主要施入有机肥提供烤烟生长所需养分［1］，改变了烤烟常规种植中主要施入无机肥来提供养分的生产模式，生产的烟叶化学品质和外观品质均得到较大提高，但在有机种植方式下植烟土壤性质是否发生变化尚不清楚。而微生物参与土壤有机质分解、腐殖质形成、养分转化和循环等过程，对植物养分供应起决定作用，土壤微生物多样性及其群落结构是评价土壤品质的重要指标［2-3］。目前，针对有机种植方式下烟田土壤微生物特征的研究较少，其中多为运用平板培养法计算微生物数量及多样性［4-10］，利用分子生物学方法研究微生物群落及其多样性却少见报道［11］。平板培养法可以较为直观地统计微生物的数量，但土壤中多数微生物为不可培养型，平板培养法无法检测到。因此，运用基因克隆和末端限制性片段长度多态性（TRFLP）技术，拟从土壤微生物及其理化性质方面，揭示喀斯特典型山区烤烟由常规种植转变为有机种植后的综合效果及影响土壤微生物变化的原因，为有机烤烟生产的可持续发展提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况及样品采集

研究区位于贵州省毕节市金沙县，处于中国西南喀斯特典型山区。金沙县地跨东经105°47′～106°44′，北纬27°07′～27°46′，海拔1 100～1 400 m，属北亚热带湿润季风气候。年均气温12.5～16.5℃，昼夜温差大，年均降雨量1 050 mm，年均日照数1 098 h。植烟区土壤主要为石灰土、黄壤、粗骨土、紫色土和潮土。

以金沙县通过南京国环有机产品认证中心（OFDC）有机认证区域的有机种植方式和常规种植方式的烟田为对象，烤烟品种为K326。有机种植方式所用肥料配方为500 kg/667 m2农家肥（牛粪∶玉米秸秆=1∶1，堆沤而成）、80 kg菜籽饼、100 kg商品有机肥（贵州光勋生物肥业有限公司生产，以干基计，有机质含量≥74%，N∶P2O5∶K2O=5.4%∶1.8%∶2.6%），20 kg硫酸钾镁肥（K2O≥25%，Mg≥5%）。所有肥料全氮量约6～7 kg（N∶P2O5∶K2O=1∶0.6∶1.5），全部条施后起垄，在4月中下旬采用井窖式移栽烟苗后全生育期盖膜，种植密度为1 200株/667 m2。移栽后7～10 d施用沼液或清粪水提苗肥1次，全程不使用任何化学合成农药、生长调节剂等。常规种植方式为施用农家肥300 kg/667 m2（同上）和复合肥60 kg/667 m2（N∶P2O5∶K2O=10∶10∶25），采用条施与窝施相结合的方法，移栽前条施农家肥300 kg/667 m2、复合肥40 kg/667 m2后起垄，剩余的肥料移栽时兑水施入。

于2013年6月28日在下部叶成熟采摘前，在金沙县岩上乡选择有机种植方式（连续3年“有机高粱—有机烟叶”种植模式）和常规种植方式种植的烟田各6块，每块烟田面积不低于3 335 m2。采用“S”形多点法采集表层（0～20 cm）土壤样品，混匀后按“四分法”分取约100 g立即置于冰盒中，带回实验室于-70℃冰箱中保存，用于土壤微生物群落分析；另取约500 g带回实验室于4℃冰箱中保存，用于微生物生物量分析；另取部分样品自然风干后用于土壤基本理化性状指标分析。同时，以环刀法采样测定土壤容重。

1.2 土壤微生物群落结构分析

1.2.1 土壤微生物DNA提取

采用SDS-GITC-PEG法提取土壤微生物总DNA［12］，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小，用核酸蛋白测定仪检测DNA浓度（μg/μL）。

1.2.2 克隆文库的构建

以土壤微生物总DNA为模板，用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）与519R（5′-GWATTACCGCGGCKGCTG-3′）扩增16S rDNA片段V1-V3区［13］。采用真菌用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）-3′与ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增18S rDNA基因ITS片段［14］。将同一施肥方式下6个重复的PCR产物取等体积混合后，用试剂盒（Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System，美国Promega公司）回收目的片段。以pGEM-T载体试剂盒（美国Promega公司）对回收的PCR产物分别进行克隆。从各克隆库中随机挑取150个白斑，通过菌液PCR扩增，筛选120～130个有预期片断的阳性克隆进行基因测序（深圳华大基因科技有限公司检测）。两种施肥方式下筛选同样的序列进行分析，即细菌序列各129条，真菌序列各117条。

1.2.3 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析

随机选择每种种植方式下的4个重复，分别采用通用引物27F/519R和ITS1F/ITS4扩增细菌和真菌的rDNA片段，其中上游引物的5′端采用6-FAM荧光标记，并切胶回收。其PCR体系、扩增条件及切胶回收与构建克隆文库所采用的步骤一致。分别采用限制性内切酶HinP1I和Alu I对细菌和真菌的PCR产物进行酶切，酶切产物由上海桑尼生物科技有限公司进行基因测序。

1.3 土壤理化指标测定

采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法［15］测定土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮；参照《土壤农化分析》［16］相关方法测定土壤其他理化指标。

1.4 数据分析

各克隆库中的序列输入EMBL-EBI网站（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2）中进行比对，根据相似性95%归为一个操作单元（OTU，等同于“属”分类），采用Estimate S Win9.1.0软件和Excel 2010计算香农多样性指数、辛普森指数和均匀度指数并绘制稀疏曲线；将序列输入Ribosomal Database Project 11.3数据库（https：//rdp.cme.msu. edu）中，按相似性为85%和80%分别确定“纲”和“门”的遗传分类［17］。

T-RFLP数据参照Lukow等［18］的方法进行处理，并基于T-RFLP法得到微生物群落结构，采用Canoco 4.5软件对土壤细菌和真菌群落结构的影响因子进行冗余分析（RDA）。采用SPSS 19.0软件，以种植方式作为处理因子分别对烟田土壤基本理化性质进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 有机和常规种植方式下烟田土壤基本理化性质的变化

由表1可见，常规种植方式转为有机种植方式后，烟田土壤有机质和微生物生物量碳显著增加（p＜0.05或p＜0.01），全氮、全钾、速效磷、速效钾和容重均显著下降（p＜0.05或p＜0.01），全磷、pH无显著变化。

2.2 有机和常规种植方式下烟田土壤细菌和真菌的多样性变化

细菌和真菌克隆库的稀疏曲线（图1）显示，在“属”水平上，对于细菌，随机挑取129个克隆子还远未达到平台期，而真菌随机挑取117个克隆子已基本达到平台期。总体上克隆子数目清晰显示了两类微生物在两种种植方式下的变化趋势。

表1 有机和常规种植方式下土壤基本理化性质比较①Tab.1 Physicochemical soil properties under organic and conventional cultivation modes

由表2可见，有机种植和常规种植方式下，土壤微生物序列的OTU数量、香农多样性和辛普森多样性指数均为细菌明显高于真菌。总体上，两种种植方式下两类微生物的多样性差异不大。

图1 有机和常规种植方式下土壤细菌和真菌克隆库的稀疏曲线Fig.1Rarefaction curves of soil bacterial and fungal clone libraries under organic and conventional modes

表2 有机和常规种植方式下土壤细菌和真菌多样性Tab.2Diversity of soil bacteria and fungi under organic and conventional modes

2.3 有机和常规种植方式下烟田土壤细菌和真菌群落结构的变化

由表3可见，有机和常规种植方式的土壤细菌在“门”分类上，分别有11和12类，且均以变形菌门、放线菌门、酸杆菌门占优势，三者合计占总克隆库的54.2%～62.0%。以上3个“门”类中，又以变形菌门占绝对优势，其在有机和常规种植的土壤中分别占23.2%和27.1%。变形菌门中：有机种植方式以α-变形菌门占优势，其次为β-变形菌门，γ-变形菌门和δ-变形菌门分别只占克隆库的3.8%和3.1%；常规种植方式以β-变形菌门和γ-变形菌门占优势，α-变形菌门和δ-变形菌门分别只占克隆库的5.4%和4.7%。两种种植方式下放线菌门和酸杆菌门占克隆库的比例差异不大。

两种种植方式下，土壤中芽单胞菌门、浮霉菌门、绿弯菌门、疣微菌门占克隆库的比例为1.6%～9.3%，且均以有机种植大于常规种植方式。其中，有机种植的芽单胞菌门比例明显高于常规种植的。拟杆菌门和目前尚无法分类的细菌以常规种植大于有机种植方式。两种种植方式下均检测到少量属于拟杆菌门的细菌。此外，在有机种植方式的土壤中检测到少量常规种植方式中未检测到的硝化螺菌门和TM7类群。同时，在常规种植方式的土壤中也检测到少量有机种植方式中未检测到的厚壁菌门、WS3和Armatimonadetes。

表3 有机和常规种植方式下土壤细菌群落在“门”上的分类Tab.3Classification of soil bacterial community at phylum level under organic and conventional modes

由表4可见，有机和常规种植方式的土壤真菌在“门”分类上，分别有4和5类，且均以子囊菌门占绝对优势。在子囊菌门中，两种种植方式各有6个“纲”，但两种方式下这些“纲”占克隆库的比例差异较大，占子囊菌门绝对优势的粪壳菌纲有机种植明显高于常规种植方式；座囊菌纲在两种种植方式下差异不大，占克隆库的6.0%～5.1%；散囊菌纲和锤舌菌纲以常规种植明显高于有机种植方式；有机种植方式下检测到少量属于盘菌纲的真菌，常规种植方式下检测到少量酵母纲的真菌；此外，有机和常规种植方式下子囊菌门中有部分克隆子无法归属到“纲”。

表4 有机和常规种植方式下土壤真菌在“门”和“纲”上的分类Tab.4 Classification of soil fungal community at phylum and class levels under organic and conventional modes

接合菌门和担子菌门在两种种植方式的烟田土壤中分别占克隆库的13.7%～14.5%和7.7%～8.6%，且在两种烟田土壤中所占比例差异不大。在常规种植方式下检测到少量属于壶菌门的真菌。同时，两种种植方式下均有少量克隆子无法鉴定到“门”。

2.4 有机和常规种植方式下烟田土壤细菌和真菌群落结构的影响因素

由图2可见，土壤微生物群落的变异较大，尤其是细菌群落，但总体上有机种植方式的微生物群落聚类能与常规种植明显分开。研究区土壤微生物群落结构与土壤基本理化性质密切相关，且两种种植方式下，烟田土壤细菌和真菌群落结构与土壤环境条件的关系一致，即有机种植方式土壤微生物群落结构主要与微生物生物量碳（MBC）、有机碳（SOC）和全钾（TK）相关，常规种植方式则主要与全氮（TN）、有效氮（AN）、全磷（TP）、速效磷（AP）、速效钾（AK）、微生物生物量氮（MBN）以及土壤容重（Bulk density）相关。

图2 基于T-RFLP的土壤细菌（A）和真菌（B）群落结构与环境因子的冗余分析Fig.2Redundant analysis between soil bacteria（A）or fungi（B）and environmental factors based on the T-RFLP data

3 结论与讨论

在贵州喀斯特山区，常规和有机种植方式下土壤微生物在“门”或“纲”分类上的群落结构基本一致，细菌均以变形菌门、放线菌门和酸杆菌门占优势，真菌子囊菌门占绝对优势。常规种植转为有机种植方式后，各“门”分类的微生物比例以及土壤细菌和真菌多样性差异不大，但土壤有益微生物类群增加，具体表现为：4个亚门变形菌分布比例关系由β-变形菌门＞γ-变形菌门＞α-变形菌门＞δ-变形菌门转变为α-变形菌门＞β-变形菌门＞γ-变形菌门＞δ-变形菌门，这是土壤细菌群落结构正逐步向良好方向转变的一种表现［5］。同时，常规种植向有机种植方式转变后，土壤中出现了有益微生物如土壤氮素的硝化螺旋菌。研究区烟田土壤中均发现少量生防菌，如木霉菌（Trichoderma）和镰刀菌属（Fusarium），这些生防菌在土壤中容易形成优势种群，对土壤中许多病原菌具有拮抗生防作用［19-20］，这为进一步研究烟草根际土传病害防治奠定了基础。然而，研究区烟田土壤中还发现少数青霉菌（Penicillium）和曲霉菌（Aspergillus）。这类真菌中的某些种和亚种是植物病原菌，能产生毒素，属于烤烟病害的真菌类群［21］，因此该区烤烟生产中需注意防治这些病原菌。

通常，农田土壤中细菌数量高于真菌［22-23］。本试验中常规种植和有机种植方式下烤烟土壤微生物（细菌和真菌）多样性均为细菌显著高于真菌。大部分研究表明，与传统施肥方式相比，有机施肥方式可显著增加土壤微生物数量和多样性［24-25］。然而，该烟区由常规种植转为有机种植后，土壤细菌和真菌多样性无显著变化。其原因，一方面根据施入肥料的配方，种植方式从常规转变为有机种植后，施入大量有机肥造成施入肥料的碳氮比大大提高；土壤有机质和微生物生物量碳均极显著增加，而土壤全氮和碱解氮显著降低，微生物生物量氮也略有降低，造成土壤中碳氮比增加，加剧了微生物矿化有机质所释放的有效氮和微生物自身同化有机氮的不平衡，导致可被植物吸收利用的有效氮不足［15］，因此应根据烤烟需肥规律和土壤养分供应情况，调整施入有机肥的养分比例。另一方面，微生物群落的恢复是一个漫长的过程［26］，喀斯特山区烤烟由常规种植转为有机种植方式的年限仅为3年，种植方式的转变对土壤微生物多样性的影响可能需要更长时间才能表现出来。

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责任编辑 董志坚

Characteristic of Soil Microorganism in Karst Mountain Areas Under Organic and Conventional Cultural Practices

HUANG Huagang1,XIAO Mouliang2,3,LIANG Shichu3,ZHANG Long1,XIAO Heyou2,DAI Yuanfeng1, SHEN Yan*1,SU Yirong2,and CHEN Xiangbi2
1.Bijie Tobacco Company of Guizhou Province,Bijie 551700,Guizhou,China
2.Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region,Institute of Subtropical Agriculture,Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125,China
3.College of Life Science,Guangxi Normal University,Guilin 541004,Guangxi,China

To investigate the changes of soil microbial characteristics in Karst mountain areas caused by the transformation from conventional cultivation into organic cultivation,an experiment was carried out in tobacco fields on which organic cultivation had been conducted for three consecutive years in Jinsha County,Guizhou Province by taking conventional cultivation as the control.The basic soil properties, bacterial and fungal community structure and key influencing factors were studied.The results showedthat:comparing with conventional cultivation,the contents of soil organic matter and microbial biomass carbon significantly increased,the contents of soil nutrients（total nitrogen,total potassium,available phosphorus，available potassium,etc）significantly decreased（p＜0.05）,and the amount of beneficial microorganism groups increased as a result of organic cultivation.The richness and diversity of bacteria were higher than those of fungi were common to both cultural practices.The diversities and microbial communities at phylum level were not obviously different between conventional and organic cultural practices.Bacterial communities dominated by Proteobacteria,Actinobacteria and Acidobacteria（accounted for 54.2%-62.0%）,and fungal communities dominated by Ascomycota（accounted for 74.4%）.The microbial communities in Karst mountain areas were mainly influenced by the organic matter,nutrient and bulk density in soil.

Karst mountain area；Flue-cured tobacco；Organic cultivation；Conventional cultivation；Soil microorganism；Bacterium；Fungus

S572.61

A

1002-0861（2015）11-0016-06

10.16135/j.issn1002-0861.20151104

2014-11-21

2015-05-19

贵州省烟草公司毕节市公司科技项目“毕节市有机生产方式下烟田土壤生态特征研究”（BJYC-201301）；中国科学院西部之光人才培养计划西部博士资助项目“喀斯特典型农田土壤木质素降解特征与微生物驱动机制”（Y423035010）。

黄化刚（1982—），博士，高级农艺师，主要从事土壤生态修复研究。E-mail:huanghg82@gmail.com；*

申燕，E-mail：syan20081013@126.com

黄化刚，肖谋良，梁士楚，等.喀斯特山区不同种植方式下烟田土壤微生物特征分析［J］.烟草科技，2015，48（11）：16-21.

HUANG Huagang，XIAO Mouliang，LIANG Shichu，et al.Characteristic of soil microorganism in Karst mountain areas under organic and conventional cultural practices［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：16-21.