蒙药孟根乌苏(水银)-18 味丸中Hg、Fe、Ca、Cu、Pb 等5 种金属元素含量测定及小鼠急性毒性实验研究△

佟海英 范盎然 于 雪 张月 乌吉斯古冷 李 婧 呼日乐巴根

(1.北京中医药大学民族医药学研究所，北京 100029;2.北京中医药大学基础医学院，北京 100029;3.内蒙古自治区国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特 010020;4.内蒙古医科大学蒙医药学院，内蒙古 呼和浩特 010110)

孟根乌苏(水银)-18 味丸(简孟根乌苏-18 味丸)由水银(制)、文冠木膏、硫黄(制)等18 味药组成，临床用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、布病、皮癣、痛肿疮疡、疥癣、瘰疬、鼠疮，以及各种皮肤病，效果显著。其主要成分为孟根乌苏(水银)炮制品(简孟根乌苏炮制品)，占11.24%〔1，2，3，4〕。由于孟根乌苏-18 味丸含汞(Hg)等重金属，其安全性问题尤为突出，临床应用受到了一定的限制。然而，对其Hg、铅(Pb)等重金属含量尚缺乏含量测定研究，本文应用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)法测定成方中Hg、铁(Fe)、钙(Ca)、铜(Cu)、Pb 等5 种金属元素含量，并对复方进行小鼠急性实验研究，以期为后续更深入的研究提供一定的实验数据依据。

1 实验部分

1.1 Hg、Fe、Ca、Cu、Pb 等5 种金属元素含量测定

1.1.1 仪器与试药：微波消解仪Ethos，意大利Milestone公司;电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP -OES)，IRIS 型号：Intrepid II XSP，美国ThermoFisher 公司。所用玻璃器皿等用具均在10%硝酸中浸泡24h 后，依次用去离子水、超纯水冲净后晾干备用。硝酸(BV - III 级);HClO4(分析纯);Ca、Fe、Cu、Pb、和Hg 的单元素标准溶液，国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院，原始浓度均为1000μg/ml。

孟根乌苏-18 味丸分别收集于国家蒙药制剂中心内蒙古自治区中蒙医医院(样品1，批号：20110511)，国家蒙药制剂中心内蒙古自治区中蒙医医院(样品2，批号：20111024)，内蒙古自治区国际蒙医医院(样品3，批号：20120916)，巴彦淖尔市蒙医院(样品4，批号：08174)，鄂温克族自治旗蒙医院(样品5，2012.3 购买)，巴林右旗蒙医医院(样品6，批号：110629)，镶黄旗蒙医院(样品7，2012.6购买)，兴安盟蒙医院(样品8，批号：20090218)，库伦旗蒙医医院(样品9，批号：091214)，库伦旗蒙医医院(样品10，批号：110714)，杭锦旗蒙医院外用(样品11，2012.6 购买)，杭锦旗蒙医院内服(样品12，2012.6 购买)，四子王旗医院(样品13，2012.2 购买)，锡林郭勒盟蒙医医院(样品14，批号：121213)，呼伦贝尔市蒙医医院(样品15，批号：20120905)，呼伦贝尔市蒙医学校附属蒙医院(样品16，批号：20110617)，呼伦贝尔市人民医院(样品17，批号：20100402)，乌兰浩特中蒙药制剂有限公司(样品18，批号：20050901)，内蒙古自治区国际蒙医医院简化方(样品19，2012年5月制备)。

1.1.2 实验方法

1.1.2.1 仪器工作条件：ICP-OES 工作条件：等离子体功率：1150W，雾化气压力：26.0PSI，辅助气流量：1.0LPM，蠕动泵转数：100r/min。

1.1.2.2 内标溶液的配制：分别精密吸取Bi、Sc、Y 内标溶液适量，用5%硝酸稀释，制成每1ml 各含1μg 的混合溶液。

1.1.2.3 标准溶液的配制：ICP -OES 测试标准曲线的绘制：用从国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院购买的单元素标准溶液配制浓度分别为0、1、10、50mg·L-1(5%的硝酸介质)的混合标准溶液，用ICP 光谱仪测定各种元素不同浓度的吸收值并绘制各元素标准曲线。分析得出各元素每一浓度下检测值的RSD 值都在2%以下，所有测定元素标准曲线的R 值都在0.999 以上。

1.1.2.4 样品处理：取真空干燥6h 的孟根乌苏-18 味丸粉末约0.1g，精密称定，置洁净干燥的聚四氟乙烯内管中，加入浓硝酸2ml，在蒸汽浴上预消解10min。冷却后继续加入高氯酸5ml，盖好聚四氟乙烯罐盖，装入微波消解仪中，设定消解程序，进行样品消解。待消解完毕并冷却后，取出内管，将澄清的消化液倾入25ml 量瓶中，用适量5%硝酸洗涤内管数次，洗液并入25ml 量瓶中，加5%硝酸至刻度，摇匀。精密量取消化液0.2ml，转移至500ml 量瓶中，加5%硝酸至刻度，摇匀，即得样品溶液。同法制备10 份空白溶液。

1.1.2.5 测定法：调整仪器各项指标，使仪器各项指标达到测定要求后，编辑测定方法、干扰方程，以及选择各测定元素，引入在线内标，观察内标灵敏度，调节P/A 因子。符合要求后，将试剂空白、标准系列、样品溶液分别引入仪器，由计算机采集并记录汞及其他金属元素的信号强度。选择各元素内标和标准，根据回归方程计算样品中汞等5 种金属元素的含量。

1.2 小鼠急性毒性实验［5］

1.2.1 试药：孟根乌苏炮制品，内蒙古自治区国际蒙医医院提供(2012.5 炮制)，孟根乌苏-18 味丸，来源于国家蒙药制剂中心内蒙古自治区中蒙医医院(批号：20111024)和内蒙古自治区国际蒙医医院(批号：20120916)。

1.2.2 动物ICR 小鼠，SPF 级，雌雄各半，体重18 -20g，北京维通利华公司提供，合格证号：SCXK(京)2012 -0001。以清洁级大小鼠维持饲料饲养，由北京科澳协力饲料有限公司提供，合格证号：京饲审(2009)06166。动物饲养于北京中医药大学SPF 级动物房，整个实验过程中动物自由摄食和饮水，室温20 -22℃，相对湿度为60% ～70%，光照周期为12h，7：00 ～19：00 光照，19：00 ～7：00 黑暗，适应环境7 天后进行实验。

1.2.3 试药配置：用0.5%的羧甲基纤维素钠(CMC)配制成不同剂量的混悬液，分别供不同剂量组的实验动物使用。

1.2.4 预实验：先选择24 只ICR 小鼠进行预试验，将小鼠禁食不禁水16h，随机分成6 组，每组雌、雄各2 只。将孟根乌苏炮制品配制成(16 号小鼠灌胃针头可以抽取)2g·ml-1，浓度较稠，但灌胃给药尚可，再增高浓度时药物很难抽吸，故此浓度为最大给药浓度。给小鼠灌胃该浓度的孟根乌苏炮制品采用2 种体积，20ml·kg-1和40ml·kg-1，给药1 次，剂量分别为40g·kg-1和80g·kg-1。每天观察记录小鼠一般状态，即进食量、体重、毛色、活动及大小便情况，连续观察14 天。14 天后解剖小鼠，观察主要脏器异常变化，对观察期间死亡动物进行尸检。根据预试验结果，如无测出半数致死量(LD50)，测定最大耐受量。

1.2.5 最大耐受量测定实验将120 只ICR 小鼠按体重随机分6 组，孟根乌苏炮制品组和对照组，孟根乌苏-18 味丸(2 个批号)组和对照组，各组均有雌、雄小鼠10 只。试验前小鼠先禁食16h，不禁水。孟根乌苏炮制品可配制的最大浓度为2g·ml-1，按小鼠体重灌胃给予孟根乌苏炮制品混悬液1 次，给药体积为40ml·kg-1体重，给药剂量为80g·kg-1。孟根乌苏-18 味丸可配制的最大浓度为0.5g·ml-1，按小鼠体重灌胃给予孟根乌苏-18 味丸混悬液2次，间隔5h 给药。给药体积为40ml·kg-1体重，给药剂量为40g·kg-1。对照组灌胃给予同体积的0.5%的羧甲基纤维素钠。给药后连续观察动物的反应情况，包括一般表现、呼吸、行为、活动及有无惊厥等;毒性症状发生的时间、持续时间、恢复情况;逐日记录动物死亡数。死亡动物进行大体解剖，观察各主要脏器情况。存活动物于试验期间每日称体重。观察至给药后14 天。

1.3 统计方法

实验结果以±S 表示，采用SPSS19.0 统计软件对原始数据进行统计分析，组间比较采用t 检验;P＜0.05 为差异有显著性。

2 实验结果

2.1 Hg、Fe、Ca、Cu、Pb 等5 种金属元素含量测定结果：采用ICP-OES 法测定了18 份来自不同医疗机构和药厂的孟根乌苏-18 味丸，以及1 份简化方中的5 种金属元素的含量，其中Hg、Fe、Ca 的含量较高，但差别较大，未检测到Pb。结果见表1 和图1 -4。

表1 不同医疗机构和药厂孟根乌苏-18 味丸样品中5 种金属元素的测定结果

图1 不同医疗机构和药厂孟根乌苏-18 味丸样品中Hg 含量对比

图2 不同医疗机构和药厂孟根乌苏-18 味丸样品中Fe 含量对比

图3 不同医疗机构和药厂孟根乌苏-18 味丸样品中Ca 含量对比

图4 不同医疗机构和药厂孟根乌苏-18 味丸样品中Cu 含量对比

2.2 小鼠急性毒性实验结果

2.2.1 整体观察

部分动物灌胃后30 分钟出现腹胀现象，大概过8 -12h 后慢慢减轻;灌胃当天食欲减退;眼睛有神、对来人警觉;体毛光滑;肛门有粪渍;未见伤痕，行动无异常。

2.2.2 解剖观察

14 天观察期结束后，对存活的动物进行大体解剖，肉眼观察各主要脏器没有明显病变。

2.2.3 体重变化

孟根乌苏-18 味丸组(批号：20120916)雄性小鼠体重与对照组相比，第2、3、4 天显著降低(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)，结果变化见表2 和见图5 -7。

表2 各剂量给药组小鼠体重(g)

组别雌性给药前 第1 天 第2 天 第3 天 第4天9 21.90 ±1.20孟根乌苏炮制品组 19.90 ±1.20 20.90 ±1.29 22.80 ±1.81 22.50 ±1.78 22.50 ±1.35对照组 21.11 ±1.21 23.31 ±1.61 23.48 ±1.52 24.48 ±1.41 24.41 ±1.28孟根乌苏-18 味丸组(批号：20111024) 21.40 ±0.81 23.22 ±1.52 23.40 ±1.69 24.42 ±1.98 24.22 ±1.40对照组 19.30 ±1.64 21.50 ±1.78 22.00 ±1.05 22.40 ±1.26 22.40 ±1.26孟根乌苏-18 味丸组(批号：20120916) 18.90 ±0.88 20.60 ±1.17 21.30 ±1.34 21.40 ±1.3对照组 19.20 ±1.32 21.30 ±1.64 21.50 ±2.01 21.90 ±1.2 5 21.60 ±1.07组别雌性第5 天 第6 天 第7 天 第8 天 第9天3 22.80 ±1.90孟根乌苏炮制品组 22.75 ±0.98 23.00 ±1.70 23.40 ±1.52 23.35 ±1.25 23.10 ±1.15对照组 23.93 ±1.43 24.79 ±1.38 24.40 ±1.62 24.81 ±1.45 25.01 ±1.67孟根乌苏-18 味丸组(批号：20111024) 24.39 ±1.08 24.70 ±1.64 24.58 ±1.97 25.24 ±1.96 25.37 ±1.80对照组 22.50 ±1.18 22.40 ±1.07 22.70 ±1.06 23.00 ±1.15 23.10 ±1.37孟根乌苏-18 味丸组(批号：20120916) 21.90 ±1.10 22.30 ±1.34 22.50 ±1.43 22.80 ±1.4对照组 22.50 ±1.53 22.50 ±1.72 22.95 ±1.94 22.80 ±1.8 0 22.90 ±1.45组别雌性第10 天 第11 天 第12 天 第13 天 第14天5 23.31 ±1.82孟根乌苏炮制品组 23.87 ±1.14 23.78 ±1.35 23.60 ±1.77 23.98 ±1.34 23.95 ±1.08对照组 24.77 ±1.73 24.57 ±1.36 24.85 ±1.55 25.43 ±1.72 25.97 ±1.50孟根乌苏-18 味丸组(批号：20111024) 25.28 ±1.90 24.93 ±1.88 25.09 ±2.22 25.71 ±2.00 26.04 ±1.56对照组 23.40 ±1.07 23.30 ±1.16 23.70 ±1.49 24.00 ±1.15 24.30 ±1.46孟根乌苏-18 味丸组(批号：20120916) 23.50 ±1.90 24.00 ±1.63 23.70 ±1.34 23.60 ±1.4对照组 23.79 ±2.05 23.26 ±1.82 23.18 ±1.91 23.70 ±1.7 3 23.85 ±1.67

图5 孟根乌苏炮制品急性毒性小鼠体重变化比较图

图6 孟根乌苏-18 味丸(20111024)急性毒性小鼠体重变化比较图

图7 孟根乌苏-18 味丸(20120916)急性毒性小鼠体重变化比较图

2.2.4 孟根乌苏炮制品和孟根乌苏-18 味丸的最大耐受量：孟根乌苏炮制品可配制的最大浓度为2g·ml-1，按小鼠体重灌胃给予孟根乌苏炮制品混悬液1 次，给药体积为40ml·kg-1体重，给药剂量为80g·kg-1。孟根乌苏-18 味丸可配制的最大浓度为0.5g·ml-1，按小鼠体重灌胃给予孟根乌苏-18 味丸混悬液2 次，间隔5h 给药。给药体积为40ml·kg-1体重，给药剂量为40g·kg-1，约为成人(60kg)日剂量的1090 倍(为大鼠与人按照体表面积折算后的倍数，1984 版内蒙古蒙成药标准记载的孟根乌苏-18 味丸用量为1.8 ～2.2g/人/日，按照最大剂量计算，60kg 人1日内用量为0.0367g 生药/kg)。14 天观察期结束后，对存活的动物进行大体解剖，肉眼观察各主要脏器无明显病变。最大耐受量结果见表3。

表3 孟根乌苏炮制品和孟根乌苏-18 味丸最大耐受量

3 讨 论

本实验采用ICP - OES 法测定孟根乌苏-18 味丸中Hg、Fe、Ca、Cu、Pb 等5 种金属元素含量，测定结果表明，不同医疗机构孟根乌苏-18 味丸样品中Hg、Fe、Ca 的含量较高，但差别较大，未检测到Pb。其所含的金属元素中，Fe 和Ca 为对人体有益的金属元素，如Fe 及其配合物具有明显的抗菌消炎作用，Ca 对细胞功能的维持、酶的活性及激素分泌等都有重要作用，而参与多种酶的合成［6］。这些提示了该复方中所含金属元素在机体内发挥多种酶类作用，改变不同酶的含量及活性，从而发挥药效作用［7］。

孟根乌苏-18 味丸中君药为孟根乌苏炮制品，其主要成分为HgS，入药的炮制品基本以热制法炮制为主［8，9，10］。本次实验中，各个医疗机构孟根乌苏-18 味丸中Hg 含量差别较大，呼伦贝尔市蒙医医院和呼伦贝尔市蒙医学校附属蒙医院样品中Hg 的含量较高，达到了每克含4 万μg 以上。在内蒙古自治区国际蒙医医院简化方中Hg 的含量只有126μg，这也说明了不含炮制品的样品中Hg 的含量确实很低。此外，四子王旗医院提供的孟根乌苏-18 味丸中Hg的含量只有124μg，这可能说明该复方不含孟根乌苏炮制品，在后续的研究中，利用X -射线衍射仪(XRD)检测Hg的存在形态实验中，也发现该复方中不含HgS 类化合物。通过相关咨询，得知该医院未自己生产孟根乌苏-18 味丸，是从藏区引进的，故可能为藏药十八味欧曲丸。通过本实验观察到所收集的18 份孟根乌苏-18 味丸中，Hg 的含量范围从3554 -47571(μg/g)不等，而同一医院国家蒙药制剂中心内蒙古自治区中蒙医医院提供的2 个批号样品中Hg 的含量也不一致，达到了12904 和18474(μg/g)。另额尔登桑［11］等也对国家蒙药制剂中心内蒙古自治区中蒙医医院(未写批号)提供的孟根乌苏-18 味丸中Hg 的含量进行研究，结果为6385(μg/g)。这也说明了各个医疗机构因孟根乌苏炮制方法，以及配方等的差别原因，导致复方中Hg、Fe、Ca 等金属元素含量差别较大，需在今后的医疗实践中，规范孟根乌苏的炮制方法。

小鼠急性毒性实验结果表明，孟根乌苏炮制品和孟根乌苏-18 味丸均未测出LD50，孟根乌苏炮制品的最大耐受量为80g·kg-1。孟根乌苏-18 味丸最大耐受量为40g·kg-1，约为成人(60kg)日剂量的1090 倍。关于孟根乌苏炮制品的最大耐受量方面，侯敏［12］等的研究结果表明，其热制水银的最大耐受量为2.8g·kg-1。关于孟根乌苏-18味丸的最大耐受量方面，本研究团队的包勒朝鲁［13］等的研究结果为40g·kg-1。这些实验结果的差别与孟根乌苏的炮制方法，所受试药物的批次不同，以及每个实验室的实验方法，实验技术等有关。

孟根乌苏-18 味丸中Hg 的含量较高，其体内蓄积靶器官以及毒性如何等有待进一步深入研究。

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