头穴透刺对脑出血大鼠脑含水量及AQP-4 表达研究*

李雪岩，师 帅，李德韬，包 瑞△

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001;2.大庆油田总医院脑血管医院，黑龙江大庆163000)

中风病作为常见病，其发病年龄日趋年轻化，笔者在探寻更好的治疗方案中发现，头穴透刺治疗疾病，可以减少针刺的数量，而达到最佳的治疗效果。本实验进行头穴透刺与脑含水量及水通道蛋白4(AQP-4)的关系研究，希望对医疗实践有所帮助。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性Wistar 大鼠，重(250 ～300)g。

1.2 实验试剂

①AQP-4 试剂盒，武汉博士德生物有限公司;②多聚赖氨酸，广州市一科生物有限公司;③伊文思兰，上海远慕生物技术有限公司;④多聚甲醛，南京中科联实业有限公司;⑤磷酸氢二钠，上海剑诚化工有限公司;⑥氯化钠，分析纯，广州市一科生物有限公司;⑦磷酸二氢钠，郑州超凡化工食品有限公司。

1.3 实验设备

①KD-BM 生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;②HD-300 自动脱水机，湖北慧达仪器公司;③微量注射器，上海高鸽工贸有限公司;④307-B 台式，牙钻机，安徽中科都菱股份有限公司;⑤电子天平，松山仪器设备有限公司;⑥RM2235 石蜡切片机，北京瑞莱宝泰科技发展有;⑦TEC-2500 型展片机，常州市郝思琳医用仪器有限公司;⑧TKY-TKA烤片机，湖北泰康医疗设备有限公司;⑨恒温低温冰箱，陕西海联化玻仪器化工有限公司;○10电热恒温箱，上海善志仪器设备有限公司;○1 数码相机，韩国;○12ZH-蓝星B 型立体定位仪，中国安徽仪器厂;○13JD801病理图像分析系统，江苏省捷达科技发展有限公司;○14图像分析软件，Motic 公司生产;○15TDZ5-WS多管架自动平衡离心机，湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司;○16JEM-2010 透射电子显微镜，日本电子株式会社。

1.4 动物分组及处理

将96 只健康雄性大鼠随机分为3 组:对照组32只、模型组32 只、针刺组32 只，每组分4 个时间点，每个时间点8 只大鼠。于造模成功6 h 后，给予相应的针刺治疗，然后在对应的4 个时间点(12 h、24 h、3 天、7 天)停止治疗，取材;每个时间点4 只测定脑含水量，另外4 只检测AQP-4 表达。

对照组:将2 ul 0.9%的生理盐水注入脑内尾状核中心部。

模型组:造模后12 h、24 h、3 天、7 天分别取材。

针刺组:造模成功6 h 后，给予针刺治疗，针刺脑出血侧百会穴透悬厘穴1 次/天;留针30 min，10 min捻转1 次，每次1 min，以200 转/min 速度捻针;针刺治疗后于12 h、24 h、3 天、7 天分别取材。取穴方法参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》。

1.5 造模

根据图谱确定鼠尾状核。定向注射胶原酶诱发大鼠ICH 模型。麻醉，消毒，定点、定位后，用自动推进器按每只0.8 U(0·1 U/μL)胶原酶Ⅶ，以1 μL/min 的速度注入一侧尾状核，出针。缝合，局部消毒。

1.6 标本制备

麻醉，暴露心脏，插管，于右心耳做出口。灌注，流出液变清，灌注，标本变硬。取脑，切片，固定，脱水、浸蜡、包埋制成石蜡切片用于AQP-4 免疫组化检测。

1.7 测定含水量

脑含水量:BWC=(WW-DW)/WW×100%。

脑组织至铝箔表面，吸干脑脊液，称其总重。湿重(WW)= 总重- 己称重的铝箔重量;然后包好放入100℃的恒温干燥箱内烘干24 h，取出恢复到室温后，得总重2。干重(DW)=总重2-己称重的铝箔重量。

1.8 检测AQP-4

石蜡切片，脱蜡→孵育→蒸馏水冲洗、修复液修复，冷却，PBS 冲洗→滴加一抗，4℃冰箱过夜→PBS 液冲洗→滴加生物素标记→PBS 液冲洗→滴加辣根酶标记→PBS 液冲洗→DAB 显色→流水冲洗、苏木素复染脱水、透明→中性树胶封片。

1.9 AQP-4 免疫组化图像分析

每只大鼠共染色5 张切片，每张切片选取4 个区域进行观察并分析阳性区面积百分比。

1.10 统计方法

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织含水量比较

针刺组各时间点控制脑含水量优于对照组与模型组(P ＜0.05);对照组各点脑含水量低于模型组(P ＜0.05)，说明针刺组有效的控制了脑水肿，促进脑出血恢复。如表1。

2.2 各组大鼠脑组织AQP-4 表达比较

针刺组各时间点控制AQP-4 的表达效果优于对照组与模型组(P ＜0.05);对照组的各点AQP-4 的表达低于模型组(P ＜0. 05)，说明针刺组抑制了AQP-4 的表达，减轻了脑水肿，修复了神经元细胞。如表2。

表1 针刺对脑出血大鼠脑组织含水量的影响(±s)

表1 针刺对脑出血大鼠脑组织含水量的影响(±s)

组别 n 12 h 24 h 3 天 7天对照组 4 75.81±0.59 76.39±0.56 77.01±0.49 75.14±0.41模型组 4 77.96±0.38 79.76±0.49 84.01±0.40 80.12±0.41针刺组 4 76.61±0.31 77.27±0.41 78.13±0.39 76.12±0.42

表2 各组大鼠脑组织AQP-4 表达的比较(±s)

表2 各组大鼠脑组织AQP-4 表达的比较(±s)

组别 n 12 h 24 h 3 天 7天对照组 4 43.71±2.68 48.28±4.18 57.21±3.45 35.43±2.37模型组 4 44.11±6.63 52.15±3.18 64.00±3.31 44.25±3.65针刺组 4 35.51±3.21 44.12±4.37 49.15±2.24 29.24±2.52

3 讨论

本实验建立在多年临床治疗实践过程中取得的疗效基础上，很多学者［1-2］通过实验证明头针对脑出血内的神经因子有促进作用。脑出血发生时血管壁为了减轻自身的压力，会向堤坝一样，裂开一个小口，释放一部分血液到脉外，使脉内的压力减轻。但是脑实质不能接纳被释放出来的血液，脑实质受到挤压，导致部分脑细胞萎缩、坏死，进而出现脑水肿。所以脑出血后如何减轻脑水肿的程度，减少脑细胞的萎缩、坏死是医者急需要解决的关键问题。针刺百会透悬厘可以促进释放出来的血液的吸收，继而减轻后续对脑组织的损伤。春、秋季节变化时，在东北地区室内室外的温差较大，很多人适应不了骤然变化的温度，特别是此时的血管伸张、收缩受到动脉硬化及血管脆化的影响易导致部分血管破裂，所以春、秋是脑出血的高发期，及早的预防也是必要的。而出血后第一时间的控制脑水肿，控制颅内压，防止二次出血也是关键。张国威等［3］应用头穴对脑出血治疗可以通过抑制内源性AQP-4 表达进而减轻脑水肿。

其实脑出血的诱发因素还有很多，在头穴透刺治疗的同时也需要考虑。比如饮食习惯、吸烟史、糖尿病史、高血压病史等。控制相关并发疾病对治疗非常重要。针刺本实验指定的穴位，其下是脑运动区(即中央前回)和脑感觉区(即中央前回)，而运用透刺可以扩大治疗范围、减少针刺的数量而达到最大的治疗效果，减少因多针带给患者的拒绝接受针刺治疗。李妍、杨奎等［4-5］通过药物治疗脑出血大鼠后也证实控制AQP-4 的表达可以抑制脑水肿形成。本实验中针刺治疗后检测AQP-4 的表达可以看到:针刺组对其都有抑制作用，进而控制脑水肿的程度。从本实验数据看针刺后控制了大鼠的脑水肿程度，同时参考李妍等学者的实验结论，考虑未来可以进行针刺联合药物治疗的实验设计方案，期待会有更好的效果。

查阅资料发现针灸十二经筋的走行特点一部分命名为维筋相交，手阳明经筋循行也是交叉的，说明先人早已理解脑部管理肢体运动是交叉性的，而治疗也是根据这一理论。笔者经过长期的临床观察又通过现在的实验研究可以充分证实本针刺方法是有效的，也是值得推广应用的。本实验的治法优点在于:首先，针刺数量少，减少了因多针针刺使个别患者因恐惧而拒绝治疗;其次，扩大治疗范围，透刺后贯穿了管理对侧肢体的运动和感觉功能区，以此达到最大的治疗效果;再次，通过针刺对经络的调控机制，促进了瘀血的吸收同时减轻脑组织的水肿和细胞的凋亡。

本实验通过针刺百会透悬厘治疗脑出血大鼠证明:头穴透刺减轻脑水肿并修复脑细胞，降低脑含水量而促进脑出血恢复;头穴透刺对脑内AQP-4 的表达有抑制作用，进而控制脑水肿而保护脑受损的神经元。

［1］ 邹伟，刘芳，孙晓伟，等.头针对急性脑出血大鼠BDNF 和NGF 表达的影响［J］.中医药学报，2010，13(6):13

［2］ 石秋艳，何俊芳，孙惠芳，等.脑出血大鼠脑内NGF 和BDNF 蛋白表达变化的研究［J］.中国医药指南，2010，8(7):7

［3］ 张国威，邹伟，刘芳，等.“百会”透“曲鬓”对急性脑出血大鼠脑组织AQP-4 表达影响的实验研究［J］. 中医药信息，2010，6(3):34-35

［4］ 李妍，崔向宁，陈泽涛，等. 活血化瘀中药对脑出血大鼠脑组织含水量及AQP4 表达的影响［J］. 中国实验方剂学杂志，2011，3(19):23-24

［5］ 杨奎，戴扬，邬春久，等. 栀子总环烯醚萜苷对大鼠脑出血AQP4和MMP-2/9 表达的影响［J］.中药药理与临床，2010，9(2):22