绿原酸磷脂复合物固体分散体的体外溶出和药动学研究

赵安权　王倩倩　李佳　樊萌春　贺英菊

摘要：为研究绿原酸磷脂复合物固体分散体（CA-PC-SD）的体外溶出以及体内药动学规律，采用HPLC法考察CA-PC-SD的体外溶出，大鼠灌胃后测定其血药浓度，并采用DAS 2.0软件分析计算药动学参数。结果显示：CA-PC-SD显著改善绿原酸磷脂复合物（CA-PC）的溶出效果，相较于原料药（CA）其相对生物利用度提高2.12倍。表明CA-PC-SD能显著改善CA-PC的体外溶出特性以及cA的口服生物利用率。

关键词：绿原酸；磷脂复合物；固体分散体；溶出度；药动学；口服生物利用度

文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2015）01-0054-04

0引言

绿原酸（chlorogenic acid，cA），是一种苯丙素类化合物，由咖啡酸（caffeic acid）和奎尼酸（quinic acid）缩合而成，又名咖啡鞣酸，在金银花、野菊花、杜仲、蒲公英、向日葵等多种植物中均有发现。绿原酸生物活性十分广泛，具有利胆、抗菌、抗病毒、稳定血糖、增加白血球、止血、缩短血凝和出血时间以及增强免疫等多种药用功能；但由于其脂溶性差、体内消除半衰期短、代谢广泛、口服生物利用度低，从而限制了临床的应用。研究表明，磷脂复合物能有效提高药物的脂溶性，但由于磷脂复合物的溶出效果不佳，极大影响了口服生物利用度。本文将绿原酸磷脂复合物进一步制成绿原酸磷脂复合物固体分散体，旨在改善磷脂复合物的溶出效果，并与原料药cA和磷脂复合物（CA-PC）相比较，研究了大鼠体内的药动学过程及生物利用度，为绿原酸口服新剂型的研制提供了实验依据。

1材料

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津）；CPA225D型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；RE-52CS旋转蒸发仪（上海雅荣生化设备有限公司）；85-2恒温磁力搅拌器（常州普天仪器制造有限公司）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；ZP-200振荡器（江苏太仓市实验设备厂）；DW-F L270低温冰箱（中科美菱）。绿原酸原料（自制）；绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110753-201314，纯度96.6%）；葛根素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110752-200912，纯度96%）；大豆卵磷脂（德国Lipoid）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30，成都市科龙化工试剂厂）；甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯。雄性SD大鼠（四川大学华西实验动物中心），体重（210±20）g。

2方法与结果

2.1样品的制备

由于课题组在前一阶段已经完成对绿原酸磷脂复合物（CA-PC）的最佳工艺研究，即在20℃下，以无水乙醇为反应溶剂，绿原酸与磷脂最佳质量比为1：1，反应体系中绿原酸质量浓度为7.5 mg/mL，磁力搅拌2 h。反应完成后在体系中继续加入一定量的PVP-K30，超声5min使其溶解，转至旋转蒸发仪中，60℃除去无水乙醇即得绿原酸磷脂复合物固体分散体（CA-PC-SD），粉碎，过筛，装胶囊备用。

2.2 CA-PC-SD中CA的体外含量测定方法

1）色谱条件。采用Aichcrombood AQ C18色谱柱（250 minx4.6 minx5 μm），以乙腈-0.1%磷酸（20：80）为流动相，检测波长323 nm，柱温40℃，流速1mL/min，进样量20μL，测得结果如图1所示，制剂中辅料不会干扰CA的测定，此色谱条件下CA与杂质分离良好。

2）线性范围的考察。取适量的绿原酸对照品，精密称定，用甲醇溶解并配制储备液。精密吸取适量储备液，配制质量浓度分别为3.90，7.80，9.75，15.60，19.50，23.40，31.20，39.00，58.50μg/mL的对照品溶液，进样并记录峰面积。以样品浓度对峰面积进行线性回归，回归方程为Y=717987X-54210（r=-0.9995），线性范围为3.90～58.50μg/mL。

2.3 CA-PC-SD中CA体内分析方法的建立

1）血浆样品的处理。大鼠尾静脉采集血样0.3 mL，置于预先肝素化的0.5mL离心管中，振摇，8000r/min离心5 min，取上层血浆100μL于另一0.5 mL离心管中，加入内标（含葛根素100μg/L）的甲醇溶液100μL以及100μL甲醇-0.2%磷酸溶液（20：80），涡旋振荡2min，8000r/min离心5min，取上清液20μL进样。

2）色谱条件与专属性考察。采用Aichcrombood-AQ C18色谱柱（250 mmx4.6 mmx5 μm），以乙腈-0.2%甲酸（15：85）为流动相，检测波长323 nm，柱温40℃，流速1 mL/min，进样量20μL。在此色谱条件下，测得空白血浆、空白血浆加CA对照品和内标葛根素、大鼠血浆样品加内标葛根素的色谱图（见图2）。由图可见，CA的峰形良好，内源性物质不干扰CA与内标的分离测定。

3）血浆标准曲线。取适量的绿原酸对照品，精密称定，用甲醇溶解并配制成储备液。精密吸取储备液适量，用甲醇溶液稀释，得质量浓度分别为25.88，51.75，103.50，207.10，414.10，828.13，1 656.25 ng/mL的标准CA溶液各100μl，加入空白血浆100μl，混匀，配成含CA的标准血浆样品，按2.3.1血浆样品处理步骤和2.3.1方法进样，记录峰面积。以CA与内标峰面积之比（y）对血浆中CA的质量浓度（x）进行线性回归，回归方程为Y=0.0002X+0.009 1（r²=0.9993），线性范围为25.88～1 656.25 ng/mL。

4）精密度试验。取15支0.5 mL离心管，均分为3组，加入空白血浆100μL，加入质量浓度分别为25.88，207.10，1656.25 ng/mL CA对照品溶液100μL，混匀，配成含CA的标准血浆样品，于1d内连续测定5次及连续测定3d，计算日内、日间精密度。其日内精密度RSD分别为4.85%、3.93%、2.73%，日间精密度RSD分别为5.04%、4.83%、3.95%，结果说明此方法的精密度良好，符合生物样品的测定要求。

5）回收率实验。取15支0.5mL离心管，均分为3组，加入空白血浆100μL，分别加入低、中、高3种不同质量浓度的绿原酸对照品溶液100μL，混匀，配成含CA的标准血浆样品，按照所建立的方法进行处理及测定，测得低、中、高质量浓度分别为25.88，207.10，1656.25ng/mL的含CA样品的回收率分别为100.8%、99.7%、101.4%。

6）样品稳定性考察。取空白血浆100μL，制备质量浓度分别为25.88，207.10，1 656.25 ng/mL的含药血浆样品（n=5），按2.3.1方法处理后，室温放置0，10，24 h后再测定，记录样品峰面积，计算实测质量浓度，并与0时刻测定结果进行比较。结果表明低、中、高3种质量浓度的样品放置0，10，24 h后，RSD均≤5.0%。

2.4体外溶出试验

取CA-PC及含不同量PVP-K30的固体分散体（CA-PC-SD），碾碎，研磨装胶囊，采用中国药典规定的小杯法，于200mL水中，温度（37±0.5）℃，转速100 r/min，CA-PC分别于10，30，60，90，120，180min，而CA-PC-SD分别于5，10，20，30，45，60，90min取样5mL，并同时补充同温等量新鲜介质，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液1mL稀释后，照含量测定2.2.1方法进样检测，测定绿原酸质量浓度，计算累积释药百分率，结果见图3。

从图中不难看出CA与PVP-K30以1：3、1：5、1：7的比例形成CA-PC-SD时均能够显著提高溶出效果，相较于CA-PC，在溶出速率和溶出百分比上优势明显，而从最终产物的聚集状态、反应时间和成本等因素考虑，优选1：5时为最佳处方进行生物利用度的考察。

2.5大鼠体内生物利用度实验

将15只SD雄鼠随机分成3组，正常饲养一周，实验前禁食12h，只给饮水，分别灌胃给予200mg/kg的原料药CA和相应剂量的CA-PC以及CA与PVPK30之比为1：5的CA-PC-SD。原料药CA组分别于3，10，17，25，35，60，90，180，240，300，360，480 min断尾静脉取血，其余组分别于8，15，30，45，60，90，120，150，240，360，480，500min断尾静脉取血，然后迅速装入肝素化的0.5mL离心管中，振摇，8000r/min离心5min，分离血浆，于-40℃冰箱储存。取血浆100μL按2.3.1方法处理后，按2.3.2下条件进样测定，根据则定结果绘制CA的平均血药浓度一时间曲线，如图4所示。

采用药动学DAS 2.0软件分析计算主要药动学参数，根据二室模型依赖性参数估算方法，求得两者的药动学主要参数，结果见表1。

由表中的主要药动学参数可以看出：CA-PC-SD较原料药CA和CA-PC而言，AUC_0-t、AUC_0-∞均明显增大，表明前者的吸收比后二者显著改善。CA-PC-SD的平均达峰时间T_max以及MRT_0-t也较原料药CA延长，可见其在体内的吸收时间延长，平均滞留时间增加。从C_max可以看出，CA制成磷脂复合物固体分散体后，F=（AUC_CA-PC-SDAUC_CA）×100%=（3 095.0/1 548.4）×100%=212.2%，结果表明CA制成磷脂复合物固体分散体后，口服生物利用度提高2.12倍。

3讨论

CA属于生物药剂学中第3类药物，水溶性好，脂溶性差，因此口服生物利用率低。实验从改善其口服生物利用率入手，旨在以磷脂复合物这一剂型为载体改善其脂溶性，从而间接提高跨膜能力，促进口服吸收。但课题组前一阶段的研究中发现，虽然磷脂复合物确实积极的改观了CA的脂溶性，但是由于CA-PC的溶出效果太差，直接影响了生物利用度的提高。所以，作者将磷脂复合物进一步开发为固体分散体，从实验数据可以看出，固体分散体的溶出速率和累积溶出百分比都大大优于磷脂复合物组，这对固体制剂口服生物利用度的影响必然是有益的。实验中选择CA与PVP K30的比例为1：5的固体分散体与原料药CA和CA-PC相比较，进行大鼠药动学的试验，得到了更为确切的结论：CA-PC-SD的AUC。AUC_0-∞、C_max均远高于CA和CA-PC组，这也充分说明溶出效果的改良能促进口服生物利用度的提高，表现出了良好的体内外相关性。

从大鼠药动学的结果分析CA-PC组的吸收效果提高并不明显，但表现出了一定的缓释能力，这可能与其释药行为有关。

4结束语

本实验将CA制备成CA-PC-SD，有效改善了其口服吸收，并建立了CA的体内外检测方法，为其体内外检测提供了理论依据，对CA的体外溶出的研究和体内生物利用度的考察，为CA口服新剂型的研制提供了参考。