基于多芳环多吡啶配体的单功能铂配合物DNA结合研究

陈司汉,周炳荣

(1.乐山职业技术学院，四川 乐山 614000； 2.南京医科大学 医学科学部，江苏 南京 210029)



基于多芳环多吡啶配体的单功能铂配合物DNA结合研究

陈司汉1,周炳荣2

(1.乐山职业技术学院，四川 乐山 614000； 2.南京医科大学 医学科学部，江苏 南京 210029)

目的 验证配体2,4,6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)配合物的DNA结合能力。方法 合成一个多芳环多吡啶配体2,4,6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)。配体(L4)与Pt(DMSO)2Cl2反应得到配合物4，表征配合物，通过紫外、荧光和凝胶电泳的方法研究了配合物4的DNA结合能力。结果 紫外和荧光实验表明该配合物均可与DNA嵌入结合，结合常数分别为2.1×104M-1、 2.78×107M-1。凝胶电泳实验表明配合物可使 DNA 超螺旋形式完全解旋，有效扰乱 DNA 的二级结构。结论 配体2,4,6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)配合物与 DNA 具有较强的结合能力，可以缓慢结合形成 DNA 的加合物，并且能够有效扰乱DNA构象。

铂配体；DNA结合；合成

癌症一直是困扰人类健康和生命的杀手。铂类抗癌剂对睾丸肿瘤和卵巢癌有特效外，对子宫颈癌、淋巴瘤、膀胱癌等也有治疗作用[1]，其中顺铂(cisplatin，DDP) 是一种临床应用极为广泛的含铂类化疗药物，其主要作用靶点是DNA。顺铂对RNA和蛋白质合成的抑制作用较弱，属周期非特异性药物。顺铂虽用于治疗一些癌症，但抗肿瘤谱仍相对狭窄，有些肿瘤细胞系天然抗药性，有些在接受初始治疗后产生抗药性[2-3]。顺铂水溶性不高，需要采取静脉注射给药，这给患者带来了极大的不便[4]。为了克服顺铂的上述缺点，铂类抗肿瘤药物进入了一个快速发展时期，先后出现了5类顺铂类似物(卡铂、奥沙利铂、奈达铂、洛铂、庚铂)[5]，但由于结构与顺铂相似，并没有从根本上解决顺铂存在的缺陷[2]。

毒性和抗药性是铂类抗癌药物需要解决的主要问题。在最近的几年中，人类又设计出单功能铂和多核铂，这些铂类配合物与顺铂及其类似物有着完全不同的结构特征[6-8]，因而它们与DNA的作用方式也有可能完全不同于顺铂。鉴于迄今为止，有关多核螯合铂类配合物的研究报道的极少，该类配合物的构效关系也还未曾被探讨过[9-10]。本实验中以2，4，6-三(4-亚甲基苯基)-1，3，5-三嗪桥连了3个二(2-吡啶甲基)胺，得到配体2，4，6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1，3，5-三嗪(L4)。该配体与Pt(DMSO)2Cl2反应得到1个多芳环三核三氮螯合铂配合物(4)，研究了配合物4的DNA结合能力。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 对甲基苯腈购自 TCI；K2[PtCl4]、2-氯甲基吡啶、2-氨甲基吡啶和二异丙基乙基胺均购自阿拉丁；甲醇、丙酮、氯仿、NBS、偶氮二异丁腈(AIBN)和三氟甲环酸购自南京凯基生物科技发展有限公司。pUC19 质粒 DNA购自大连宝生物有限公司；小牛胸腺DNA(CT-DNA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(EB)购自Sigma。

1.2 仪器 Bruker Advance/AV 500 MHz核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)； LCQ电喷雾质谱仪，Isopro3.0软件(美国ThermoFinnigan公司)； Shimadzu RF-5310荧光光谱仪(日本岛津公司)；TU-1900紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)； BIO-RAD电泳仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)；凝胶成像系统Gel Doc XR(美国BioRad公司)；DigiDoc-ItTM系统(美国UVP公司)。

1.3 方法

1.3.1 配体及配合物的合成：①合成溴甲基苯腈[11]：向50 mL的茄形瓶中加入对甲基苯2.1 g(18 mmol)，NBS 3.846 g(21.6 mmol)，AIBN 0.2952 mg(1.8 mmol)，氮气保护，将该混合物搅拌2 min，使其混合均匀。升温至60 ℃～70 ℃，至原料反应完全，约5 h，瓶内为红褐色稠状液体。停止搅拌，降至室温，红褐色稠状液体逐渐固化，加入45 mL乙醚洗涤，为灰黑色悬浊液。将该悬浊液抽滤，取滤液(滤液为黄色液体)。将滤液旋蒸至干。

②合成2，4，6-三(4-溴甲基苯基)-1，3，5-三嗪：往25 mL的茄形瓶中加入10 mL三氟甲磺酸，称取5 g(42.7 mmol)对溴甲基苯腈，在冰浴上分批次加入茄形瓶中，剧烈搅拌，加完后，在茄形瓶上插上一根干燥管，搅拌 5 d。反应结束后，往瓶中加入大量水，出现大量白色固体，用浓氨水调节pH至中性。抽滤，固体用水洗涤(3次)。

③ 合成二(2-吡啶甲基)胺[12]： 向250 mL的三口瓶中加入2-氨甲基吡啶(10.3 mL，0.1 mol)，Zn粉(20 g)，冰醋酸(20 mL)，95%乙醇(100 mL)的混合物，60 ℃～70 ℃下剧烈搅拌，氮气保护。往混合物中加入2-吡啶甲醛(9.5 mL，0.1 mol)，2 h内加完。补加Zn粉(40 g)、冰醋酸(40 mL)，2 h内加完。加完后继续保持60 ℃～70 ℃ 5 h。关闭反应，室温下保持一夜，过滤沉淀，滤液旋蒸。得到浅黄色浆状物，加入过量的 NaOH 过饱和溶液调节至碱性。上层为红油状，乙醚萃取并用无水硫酸镁干燥，旋蒸。

④合成2，4，6-三[4-二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1，3，5-三嗪(L4)[13]： 向100 mL的茄形瓶中加入二(2-吡啶甲基)胺(1.2038 g，6 mmol)，40 mL氯仿，剧烈搅拌。加入有机碱(二异丙基乙基胺)(0.78 g，6 mmol)，搅拌一段时间。将称好的 2，4，6-三(4-溴甲基苯基)-1，3，5-三嗪(1.176 g，2 mmol)倒入茄形瓶中，搅拌4 d，至溶液由黄色变为红褐色，停止搅拌(使用薄层色谱监控反应的进度)。用50 mL的水洗涤，并用无水硫酸镁干燥，旋蒸至干。粗产物用硅胶柱色谱(淋洗液为CHCl3:CH3OH=40:1，氨水少许)进行提纯。

⑤合成Pt(DMSO)2Cl2[14]： Pt(DMSO)2Cl2按照文献方法合成：称取K2[PtCl4] 1.245 g(0.003 mol)，溶于10 mL二次蒸馏水中，加入DMSO(0.009 mol)，室温下静置1 d，析出黄色针状晶体。过滤，用水、乙醇、乙醚。

⑥合成配合物(4)：配体L4(63.6 mg，0.0675 mmol)溶于12 mL甲醇，搅拌。Pt(DMSO)2Cl2(85.5 mg，0.203 mmol)用60 mL的甲醇超声溶解，加入上述溶液中，搅拌5 d，溶液由清变浑。抽滤得到黄色固体33 mg，滤液浓缩至2 mL，加入乙醚，有固体出现，继续抽滤得到固体3 mg。

1.3.2 与DNA结合能力：CT-DNA 的储备液配制在5 mmol/L Tris-HCl/50 mmol/L NaCl的水溶液中(pH=7.4)，EB也在该缓冲溶液中配制，浓度为2×10-3mol/L，DNA浓度通过测定其 260 nm 处的吸光度来确定(DNA 在 260 nm 处的摩尔消光系数为 6600 M-1cm-1)，且在260 nm和280 nm处的吸收强度之比为1.8～1.9，表明该DNA样品不含蛋白质。

① 紫外可见光谱

配合物浓度为2×10-5mol/L，测定前将溶液放在(25±0.1) ℃的恒温水浴中。取石英杯2只，分别加入TE缓冲液2990 μL。在对照杯中加入10 μL TE buffer，在样品杯加入10 μL样品。实验组中加入测试液，其中CT-DNA与配合物(2×10-5mol/L)的摩尔浓度比例为 0.5(DNA/[配合物])，盖上盖子，上下几次摇匀。放入751型分光光度计的比色槽中，使用氢灯，分别测出OD240～OD400的之间的吸收光谱值。记录溶液随时间变化的紫外曲线；按计算公式算出你所制备的DNA的纯度和浓度。

② 荧光光谱

于1批 5 mL刻度试管中加入 110 mL Tris - HCl缓冲溶液，加入 0.4 mL DNA 溶液， 1.0 mL BR溶液，不同量的 MTX溶液，以蒸馏水定容并且摇匀， 避光放置1 h，荧光光谱的测定中激发波长为 525 nm，发射波长为 600 nm。EB-CT-DNA体系的Tris-HCl/NaCl缓冲液(pH=7.4)3 mL，浓度为5×10-5mol/L，向该体系中每次滴加 3 mmol/L 的配合物溶液(用 DMSO 配制)3 μL，在室温下测定每次滴加样品后的荧光光谱，扫描荧光光谱或测定 525 nm 处的荧光强度

③ 琼脂糖凝胶电泳

器具清洗：将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净；根据基因组片段大小，配置琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶加入少量纯水煮沸，西班牙琼脂糖倒入锥形瓶中，摇匀并用锡纸封口，将煮好的凝胶放入65 ℃的水浴锅中，待凝胶冷却至65 ℃时，及时将凝胶倒入干净模具中。待凝胶完全凝固后电泳检测；先将干净的电泳槽排放整齐并做好标记，然后把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极；用2 μL×6溴酚黄加入到每一个胶孔中，检测凝胶胶孔是否漏孔。若不漏孔，则可在凝胶孔底部看到一条黄色条带；若漏孔，则看不到条带；.将样品pUC19质粒DNA、6×溴酚黄按3︰1的比例混匀，轻甩后按照规定的顺序上样，上样顺序应与电泳槽上的标记一致，最后点上一定量的Ladder；确认已经正确上样后，双手盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽，最后按键开始电泳；电泳结束之后，带上PE手套，小心滑出凝胶，把凝胶转移到干净的PE手套上，小心 地 将 凝 胶 放 入相 应 标 记的EB染胶盘中，盖 上 盖 子 染30 min。凝胶成像：带上PE手套，将凝胶从染胶盘中捞出，放在染胶时的PE手套上，将凝胶放入凝胶成像系统中，按照凝胶成像系统Gel Doc XR(BioRad公司)拍照。

2 结果

2.1 合成产物结果

合成的溴甲基苯腈为黄色固体。正己烷重结晶，得到1.54 g白色固体(产率为43.8%)。1H NMR(CDCl3)：δ=4.41 ppm(s，2H)，δ=7.58 ppm(d，2H)，δ=7.44 ppm(d，2H)；

合成2，4，6-三(4-溴甲基苯基)-1，3，5-三嗪，得到4.7586 g白色粗产物。甲苯重结晶得到3.6518 g白色产品(产率为73.4%)，1H NMR(CDCl3)：δ=4.58 ppm(s，6H )，δ=7.58 ppm(d，6H)，δ=8.70 ppm(d，6H)；

合成二(2-吡啶甲基)胺，得到黄色油状物9.5411 g(产率为47.95%)。1H NMR(CDCl3)：δ=3.96 ppm(s，4H)，δ=7.13 ppm(m，2H)，δ=7.33 ppm(d，2H)，δ=7.62 ppm(m，2H)，δ=8.54 ppm(m，2H)；

合成2，4，6-三[4-二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1，3，5-三嗪(L4)。得到0.318 g纯品(产率为16.88%)。1H NMR(CDCl3)：δ=3.82 ppm(s，6H)，δ=3.88 ppm(s，12H)，δ=7.17 ppm(m，6H)，δ=7.62 ppm(q，12H)，δ=7.69 ppm(m，6H)，δ=8.54 ppm(t，6H)，δ=8.70 ppm(d，6H)；ESI—MS(+)：943.75，[C60H55N12]+；

合成Pt(DMSO)2Cl2，真空干燥得到产品0.9453 g，产率为74.67%；

合成配合物(4)，2个固体核磁相同(产率约为58%)。1H NMR(d6-DMSO)：δ=4.51 ppm(s，6H)，δ=5.05 ppm(d，6H)，δ=5.47 ppm(d，6H)，δ=7.50 ppm(t，6H)，δ=7.71 ppm(d，6H)，δ=8.04 ppm(d，6H)，δ=8.21 ppm(m，6H)，δ=8.41 ppm(d，6H)，δ=8.67 ppm(d，6H)；ESI-MS(+)：545.08，[C60H54N12Pt3Cl3]3+，834.75，[C60H54N12Pt3Cl4]2+。

2.2 与DNA结合能力结果 通过紫外、荧光、和凝胶电泳的方法研究了配合物 4 的 DNA 结合能力。计算得到DNA浓度为5.9015×10-4mol/L。

2.2.1 紫外可见光谱:依赖时间的配合物 4 与 CT-DNA 的紫外吸收光谱研究显示配合物在285 nm处的最大吸收峰强度在反应15 h后产生了50%的减色效应，见图1。此结果表明配合物4是一个较强的DNA结合试剂，作用方式可能为嵌入结合，然而也不排除静电和氢键作用。

图1 r=0.5时配合物4在室温下随时间变化的紫外光谱Fig.1 UV spectrum of complexes 4(r=0.5) change with time at room temperature

滴定表明随着DNA浓度的增加，配合物在285 nm处的吸光度不断降低，见图2，在滴定结束后，盛放配合物的比色皿中出现白色的丝状物质。

图2 配合物4浓度为2×10-5 mol/L，加入不同浓度比r时的紫外光谱Fig.2 UV spectrum of complexes 4 at concentration of 2×10-5 mol/L, adding r at different concentrations

2.2.2 荧光光谱：以配合物 4 与 CT-DNA 作用的荧光滴定光谱中，每次加入配合物的浓度为3 μM，体系中600 nm的发射强度随着配合物4的滴加显著地降低了(荧光强度进行了归一化)，见图3。

图3 配合物4与EB-CT-DNA体系荧光作用曲线Fig.3 Curve of action between complexes 4 and EB-CT-DNA fluorescence system

EB-CT-DNA(50 mmol/L EB， 50 mmol/L DNA)体系荧光随加入的配合物4浓度增加而降低的变化曲线。计算结果Kapp为2.78×107M-1。

2.2.3 凝胶电泳研究：配合物4与pUC19质粒DNA在37 ℃温育24 h的凝胶电泳图见图4。此时DNA为大量超螺旋DNA[Form Ⅰ和少量开环DNA(Form Ⅱ)]的混合物。实验中ri(c)为0.66，说明配合物可以有效扰乱DNA构象，见图4。

图4 配合物4与pUC19质粒DNA在37 ℃温育24 h的凝胶电泳图1:DNA空白；2-9：ri 值分别为0.33，0.4125，0.495，0.5775，0.66，0.7425，0.825，0.9075Fig.4 The gel electrophoresis of complexes 4 and pUC19 plasmid DNA incubated at 37 ℃ 24 h 1: DNA blank；2-9：ri=0.33，0.4125，0.495，0.5775，0.66，0.7425，0.825，0.9075

3 讨论

本文合成了一个多芳环多吡啶配体三[4-二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1，3，5-三嗪(L4)，通过紫外、荧光、和凝胶电泳的方法研究了配合物4的DNA结合能力，结果表明配合物与 DNA 具有较强的结合能力，可以缓慢结合形成 DNA 的加合物，并且能够有效扰乱DNA构象。对于配合物细胞毒活性的研究仍在测试中，配合物4为一个多核的单功能铂配合物，机理明显不同于顺铂，它可为今后不同于顺铂的抗癌药物的研究起一定的指导作用。

[1] Nguyen TT,Stürup S,Gammelagaard B,et al.Metallomics in drug development: Characterization of a liposomal cisplatin drug formulation in human plasma by CE-ICP-MS[J].Anal Bioanal Chem,2013,405(6):1845-1854.

[2] Brauckmann C,Faber H,Lanvers-Kaminsky C,et al.Influence of cimetidine and its metabolites on Cisplatin-Investigation of adduct formation by means of electrochemistry/liquid chromatography/electrospray mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2013,1279:49-57.

[3] Galanski M,Arion VB,Jakupec MA,et al.Recent Developments in the Field of Tumor-Inhibiting Metal Complexes[J].Curr Pharm Des,2003,9(25):2073-2089.

[4] Boettcher A,Martin H.Kinetics of cisplatin release by in-vitro using Poly(D,L-Lactide) Coated Fe3O4Nanocarriers[J].IEEE T nanobiosci,2013,12(1):60-63.

[5] Raoof M,Cisneros B,Guven A,et al.Remotely triggered cisplatin release from carbon nanocapsules by radiofrequency fields[J].Biomaterials,2013,34(7):1862-1869.

[6] Yasuda T,Li Y,Miyatake K,et al.Synthesis and properties of polyimides bearing acid groups on long pendant aliphatic chains[J].J Polym Sci Pol Chem,2006,44(13):3995-4005.

[7] Kasparkova J,Zehnulova J,Farrell N,et al.DNA Interstrand cross-links of the novel antitumor trinuclear platinum complex BBR3464 conformation,recognition by high mobility group domain proteins,and nucleotide excision repair[J].J Biol Chem,2002,277(50):48076-48086.

[8] Oehlsen ME,Qu Y,Farrell N,et al.Effect of geometric isomerism in dinudear antitumor platinum complexes on their interactions with N-acetyl-L-methionine[J].J Biol Inorg Chem, 2005,10(5):433-442.

[9] 王晓勇,郭子建.金属抗癌药物设计的新策略和新趋势[J].化学进展,2009,21(5):845-855.

[10] Zhu JH,Zhao YM,He WJ,et al.DNA Cross-Linking patterns induced by an antitumor-active trinuclear platinum complex and comparison with its dinuclear analogue[J].Chemistry,2009,15(21),5245-5253.

[11] Rezaee M,Sanche L,Hunting DJ,et al.Cisplatin enhances the formation of DNA single- and double-strand breaks by hydrated electrons and hydroxyl radicals[J].Radiat Res,2013,179(3):323-331.

[12] Matouzenko GS,Azzedine B,Lecocq S,et al.Spin Transition in[Fe(DPEA)(NCS) 2 ],a Compound with the New Tetradentate Ligand (2Aminoethyl)bis(2-pyridylmethyl)amine (DPEA):Crystal Structure,Magnetic Properties,and Mössbauer Spectroscopy[J].Inorg Chem,1997,36(14):2975-2981.

[13] Wang Y,Liu P,Qiu L,et al.Toxicity and therapy of cisplatin-loaded EGF modified mPEG-PLGA-PLL nanoparticles for SKOV3 cancer in mice[J].Biomaterials,2013,34(16):4068-4077.

[14] Price JH,Williamson AN,Schramm RF,et al.Platinum(II) Intercalating Complexes Based on 2,2′:6′,2″-Terpyridine[J].Inorg Chem,1972,11:1280-1284.

(编校：王冬梅)

Research on single function of platinum complexes of polyaromatic polypyridine ligands on DNA interactions

CHEN Si-han1,ZHOU Bing-rong2

(1.Leshan Vocational and Technical College, Leshan 614000, China; 2.Department of Medical Sciences, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo verify the ability of ligand 2,4,6- three [two (2- pyridyl methyl) - aminomethyl phenyl]-1,3,5- triazine (L4) combined with DNA.MethodsSynthesis of an aromatic polypyridyl ligand 2,4,6- three [two (2- pyridyl methyl)-aminomethyl phenyl]-1,3,5-triazine (L4).Complex 4 was obtained by the reaction of ligand(L4) and Pt(DMSO)2Cl2,the complex 4 was characterized, electrospray mass spectroscopy.Methodsby UV, fluorescence, and gel electrophoresis study of the binding ability of complex 4 and DNA.ResultsUV-vis experiments showed that the complexes could be combined with the embedded DNA, the binding constant was 2.1×104M-1, EB-DNA binding experiments also showed that the complexes could be combined with embedded DNA, the calculated Kapp was 2.78×107M-1.Gel electrophoresis experiments showed that the complexes could make DNA from the supercoiled form to complete unwinding, and two level structure effectively disrupt DNA. ConclusionThe ligand of 2,4,6- three [two (2- pyridyl methyl) - aminomethyl phenyl]-1,3,5- triazine (L4) complexes combine with stronger binding ability with DNA, can combine to form DNA complexes, and can effectively disrupt the conformation of DNA.

platinum ligand; DNA binding; synthesis

国家自然科学基金(81000700)

陈司汉，女，硕士，中级讲师，研究方向：生物化学，E-mail：30661641@qq.com。

R979.1

A

1005-1678(2015)02-0035-04