乌头碱对室间隔缺损模型大鼠血清锌指蛋白41和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的影响研究

余成

(海南省人民医院 心脏外科，海南 海口 570311)



乌头碱对室间隔缺损模型大鼠血清锌指蛋白41和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的影响研究

余成

(海南省人民医院 心脏外科，海南 海口 570311)

目的 探究乌头碱对室间隔缺损模型大鼠血清锌指蛋白41和半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)的影响。方法 选取80只室间隔缺损模型大鼠，随机分为2组，其中实验组40只经尾静脉注射，给予0.05 mg/kg乌头碱，连续7 d；对照组40只予等量生理盐水经尾静脉注射，连续7 d。实验结束后，各组大鼠腹主动脉取血，分别采用Western blot法和ELISA法测定血清中锌指蛋白41和SPARC，表达并进行比较。结果 Western blot结果表明，2组血清样本中，锌指蛋白41和SPARC均有所表达，但实验组锌指蛋白41和SPARC相对表达均明显低于对照组(P<0.05)；ELISA结果表明，实验组锌指蛋白41和SPARC的浓度均明显低于对照组(P<0.05)。结论 乌头碱能够明显降低室间隔缺损模型大鼠血清锌指蛋白41和SPARC的表达水平。

乌头碱；室间隔缺损；锌指蛋白41；半胱氨酸的酸性分泌蛋白

室间隔缺损(ventricular septal defect，VSD)是由于遗传因素、环境因素等导致胚胎的室间隔发育不完全而引起的一种先天性心脏疾病[1]。本病临床表现为气促、呼吸困难、反复发生的肺部感染、喂养困难、乏力、多汗、紫绀等，严重者可出现心力衰竭，临床表现的严重程度与缺损大小有关[2]。本病多发于婴幼儿，据2007年九届中国南方国际心血管病学术会议调查统计[3]，我国VSD患者的发病率为0.3%，占到小儿先天性心脏病的50%左右，并有逐年上升趋势。随着分子生物学技术的发展，本病人们更加重视疾病防治及预后，现代医学多试图从蛋白质表达与调控方面探索疾病诊断治疗的新思路[4]。研究发现[5]，目前室间隔缺损多采取手术治疗，术后多配合乌头碱等药物增强心肌收缩力，但关于乌头碱对VSD的作用研究较少。本研究旨在通过观察乌头碱对各组室间隔缺损模型大鼠血清锌指蛋白41、半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择Jcl:ICR的怀孕母鼠，在妊娠8.5 d给予70 mg/kg视黄酸，待产崽后通过动物B超仪器，筛选室间隔缺损模型大鼠80只(由中国医科大学动物实验室提供，合格证号：辽H00132)，体质量(280±30)g。大鼠均采用标准饲料喂养，自由进食，室温控制在19 ℃～23 ℃，湿度控制在55%～60%，本实验遵循《实验动物保护条例》，符合3R原则。

1. 2 主要试剂和仪器 乌头注射液(菏泽步长制药有限公司，国药准字Z37021104)；大鼠锌指蛋白41抗体、大鼠锌指蛋白41 ELISA试剂盒、大鼠SPARC抗体、大鼠SPARC ELISA试剂盒(上海凯博生化试剂有限公司)；PBS漂洗缓冲液(BOSTER公司)；Western封闭液、专用一抗二抗稀释液、DyLight 680标记羊抗鼠IgG二抗(上海双螺旋生物科技有限公司)；蛋白电泳仪、离心机(美国贝克曼库尔特公司)；Spectra Max M5酶标仪(美国Molecular Devices)。

1.3 分组给药及标本采集 将室间隔缺损模型大鼠随机分为实验组和对照组，每组40只。实验组大鼠经尾静脉注射予0.05 mg/kg乌头碱，对照组大鼠给予等量的0.9%氯化钠注射液，均连续注射7d；实验前后分别抽取大鼠的腹腔动脉血10 mL，静置于4 ℃冰箱，1 h后3000 r/min离心，取上清液，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.4 Western blot法测定锌指蛋白41和SPARC含量 在保存的各血清中加入TBS液进行稀释(10×)；加入上样缓冲液，分别于沸水、冰块中放置5 min，之后离心1 min；将各样本加入上样孔中；将电泳槽电压设置在80 V，进行电泳至分离胶染色，电压改为120 V，至染色区域距玻璃板1 cm停止；利用转膜仪将凝胶染色转至经甲醇浸泡过的PVDF膜上；室温下，将PVDF膜置入含有Western blot抗体的孵育30 min后封闭，2 h后用TBST冲洗5 min，反复进行3次；将封闭过的PVDF膜置入稀释后的大鼠锌指蛋白41抗体溶液(大鼠SPARC抗体溶液，稀释1000倍)中，4 ℃摇床过夜；将PVDF膜置入稀释后的DyLight 680 标记羊抗鼠IgG二抗(稀释1000倍)溶液中2 h；清洗后利用红外激光成像系统扫描，观察蛋白的表达量[6]。

1.5 ELISA法测定锌指蛋白41和SPARC含量 锌指蛋白41和SPARC含量测定严格按照 ELISA试剂盒说明操作。

2 结果

2.1 Western blot法检测2组大鼠血清锌指蛋白41和SPARC表达 Western blot结果表明，实验组锌指蛋白41和SPARC表达水平均明显低于对照组(P<0.05)，见图1、图2。

图1 Western blot 测定2组锌指蛋白41和SPARC的表达1-4：实验组；5-8：对照组Fig.1 Western blot results of zinc finger protein 41 and SPARC expression in two groups1-4: experimental group;5-8:control group

图2 Western blot法测定2组锌指蛋白41和SPARC含量*P<0.05,与对照组相比Fig.2 Western blot results of zinc finger protein 41 and SPARC content*P<0.05,compared with control group

2.2 ELISA法检测2组锌指蛋白41和SPARC浓度 ELISA结果表明，实验组锌指蛋白41和SPARC含量均明显低于对照组(P<0.05)，见表1。

组别 只数锌指蛋白41SPARC对照组40137.63±55.34197.05±86.49实验组40101.67±36.11*141.58±78.73*

*P<0.05，与对照组相比，compared with control group

3 讨论

室间隔属于最常见的先天性心脏病，严重影响婴幼儿的生命健康，具有较高的死亡率[7]。研究认为其发病与环境、遗传因素有关[8]，但具体的发病机制尚不明确。研究认为[9]，先天性心脏病的发生与心脏发育的信号传导通路有关，在传导中起重要作用的是各种蛋白质，锌指蛋白41和SPARC是研究最多的2种[10]。锌指蛋白41属于DNA转录因子，能够与DNA结合，调控DNA活性，影响心脏发育所必需蛋白质的产生，参与心肌细胞增殖和心脏形成过程[11]；SPARC亦称骨连接蛋白，具有影响组织分化、参与胚胎发育、调节细胞的黏附与迁移、抑制内皮DNA合成等作用[12]。很多研究表明，在室间隔缺损患者血清中锌指蛋白41和SPARC表达水平均有所升高，可以作为评价室间隔缺损的血清标志物[13]。本研究即通过观察乌头碱对室间隔缺损模型大鼠血清锌指蛋白41和SPARC的影响，来探索乌头碱对室间隔缺损的作用。

Western blot法和ELISA法是目前蛋白组学定性定量检测最常用的办法，2者在应用上各有侧重，本研究联合应用以提高结果的准确性。Western blot结果表明，实验组锌指蛋白41和SPARC相对表达值均明显低于对照组(P<0.05)；ELISA结果表明，实验组锌指蛋白41和SPARC含量均明显低于对照组(P<0.05)；提示乌头碱能够明显降低室间隔缺损大鼠血清中锌指蛋白41和SPARC的表达及含量，这可能与乌头碱能够影响心肌细胞膜内钙离子通道的开合，导致钙超载，钙信号转导随之改变，因而影响锌指蛋白41和SPARC的表达有关[14]。根据以上研究结果，可以认为乌头碱对室间隔缺损大鼠有正面作用，但具体的作用机制，还需进一步深入研究。

综上所述，乌头碱能够明显降低室间隔缺损模型大鼠血清锌指蛋白41和SPARC的表达水平。

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(编校：吴茜)

Effect of aconitine on serum zinc finger protein 41 and SPARC in ventricular septal defect model rats

YU Cheng

(Department of Heart Surgery, People’s Hospital of Hainan Province, Haikou 57031, China)

ObjectiveTo explore the effect of aconitine on serum zinc finger protein 41 and secreted protein acidic and rich in cysteine in ventricular septal defect model rats.Methods80 ventricular septal defect model rats were randomly divided into two groups, experimental group (n=40) were treated with 0.05 mg/kg aconitine via tail vein injection for 7 consecutive days; control group (n=40) were treated with normal saline via tail vein injection for 7 consecutive days. Then, the abdominal aorta blood of each rat was collected, and the contents of zinc finger protein 41 and SPARC in two groups were detected by Western blot and ELISA method,seperately.ResultsWestern blot results showed that the expression of zinc finger protein 41 and SPARC in serum samples of experimental group were significantly lower than that of control group(P<0.05). ELISA results showed that the contents of zinc finger protein 41 and SPARC of experimental group was significantly lower than that of control group(P<0.05), respectively.ConclusionAconitine can decrease the expression of serum zinc finger protein 41 and SPARC in ventricular septal defect model rat.

aconitine;ventricular septal defect;zinc finger protein 41;secreted protein acidic and rich in cysteine

余成，男，硕士，主治医师，研究方向：心脏外科，E-mail：yuchen292@163.com。

R541.1

A

1005-1678(2015)03-0042-03