正交实验法与多元非线性回归法优化苏杏二陈糖浆水提工艺的比较分析

计竹娃，金慧芳

(1.浙江医药高等专科学校 药物制剂专业，浙江 宁波 315100；2.杭州市红十字会医院 针灸科，浙江 杭州 310003)



正交实验法与多元非线性回归法优化苏杏二陈糖浆水提工艺的比较分析

计竹娃1Δ，金慧芳2

(1.浙江医药高等专科学校 药物制剂专业，浙江 宁波 315100；2.杭州市红十字会医院 针灸科，浙江 杭州 310003)

目的 通过正交实验法与多元非线性回归法，筛选苏杏二陈糖浆的最佳水提工艺。方法 以柚皮苷含量和浸膏得率为指标,运用正交试验及多元非线性回归分析法优化提取条件。结果 运用多元非线性回归法可以得到苏杏二陈糖浆的最佳水提取工艺为：无需提前浸泡，加7倍量的水提取2次，每次80 min。结论 苏杏二陈糖浆水提工艺结果准确、高效，适合生产需求。

苏杏二陈糖浆；柚皮苷；多元非线性回归法；水提；正交试验

苏杏二陈糖浆是由化橘红、茯苓、法半夏、甘草、杏仁等多味药材提取有效部位制成的中药制剂，具有宣肺、止咳，化痰的功效，用于风寒感冒所致引起的咳嗽，痰多。化橘红，即化州橘红，为芸香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’或柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮。具有理气宽中，燥湿化痰的功效，常用于咳嗽痰多、食积伤酒、呕恶痞闷[1]，是苏杏二陈糖浆处方中的君药之一。化橘红的主要成分有挥发油、黄酮类、多糖和氨基酸等[2-5]。中国药典以柚皮苷含量为化橘红的质量控制指标，因此本实验以柚皮苷含量和浸膏得率为指标，对比直观方差分析和多元非线性回归分析的差异，考察处方的最佳水提工艺，为制剂工艺研究提供准确的实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：Agilent 1260全自动高效液相色谱仪(DAD检测器)(Agilent)，BS210S电子天平(梅特勒-托利多)。

1.1.2 药品与试剂：柚皮苷对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号：110722-201312，纯度为94.7%)；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

1.1.3 药材：所用药材均购自安徽中信中药饮片厂，经宁波市药品检验所桑旭峰副主任(中药师)检验均符合《中国药典》2010年版一部标准规定。

1.2 方法

1.2.1 柚皮苷的含量测定[1]

① 色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-冰醋酸-水(35︰4 ︰61)为流动相；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：283 nm。

② 对照品溶液的制备：精密称定柚皮苷对照品5.22 mg，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷62.64 μg的溶液，即得。

③ 供试品溶液的制备：按照本文试验设计方案，按比例选取处方中五味饮片进行提取后，进一步浓缩定容至500 mL。精密量取提取液5 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

④ 线性关系考察：精密吸取柚皮苷对照溶液1、2、5、10、20 μL，分别进样，计算峰面积，以进样量(μg)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线。

⑤ 精密度试验：在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定。

⑥ 重复性试验：精密量取正交试验3号提取液6份，按照1.2.1项下③操作，分别制得供试品溶液，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定。

⑦ 回收率试验：精密量取正交试验3号提取液6份，置50 mL容量瓶中，分别加入对照品溶液5 mL，按照1.2.1项下②操作，分别制得供试品溶液，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定，计算。

1.2.2 正交试验设计

① 正交试验因素：考虑到可能影响水提取效果的主要有浸泡时间、加水倍数、提取的时间，提取的次数等4个主要因素[6-8]，故选取柚皮苷含量和浸膏得率为指标，选择浸泡时间(A)、提取时间(B)、加水量(C)和提取次数(D)4个影响因素，每个因素选择3个水平，按L9(3)4正交表设计试验[9]，优选最佳提取工艺。见表1。

表1 因素水平表

② 正交试验方法：按照按处方量称取9个处方量的化橘红、茯苓、法半夏、甘草、杏仁等5味药材136 g，分别按正交试验设计进行煎煮，滤过，分别收集每次的滤液，浓缩，定容至500 mL，备用。

1.2.3 多元非线性回归分析[10-12]：回归分析，是在掌握大量观察数据的基础上，利用数理统计方法建立因变量与自变量之间的回归关系函数表达式(称回归方程式)。每种回归又分为线性回归和非线性回归。将上述柚皮苷含量和浸膏得率为因变量(Y1、Y2)，将各影响因素的取值作为自变量(X1、X2、X3、X4)，分别做线性和非线性回归。

1.3 验证试验 按处方组成比例称取3份药材，采用优选的提取工艺进行验证试验。

2 结果

2.1 柚皮苷的含量测定

2.1.1 线性关系：通过计算其回归方程为Y=293.3X+2.2768，r=0.9998(n=5)。结果表明，柚皮苷对照在0.06264～1.2528 μg范围内线性关系良好。

2.1.2 精密度试验：主峰峰面积RSD为0.96%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性试验：峰面积RSD为2.15%，表明试验方法重复性良好。

2.1.4 回收率试验：柚皮苷的回收率分别为97.53%、99.68%、96.85 %、97.23%、99.68%、101.16%，平均回收率为98.69%，RSD为1.75%。

2.2 正交试验结果 对所得的试验结果，进行直观分析和方差分析[13]。见表2。从表2的结果可以看出，当以柚皮苷为考察指标，各影响因素的主次顺序为： D>B>C>A，即提取次数对柚皮苷的含量结果的影响最大，其次为提取时间和加水量，浸泡时间影响最小，最优组合为A2B2C3D2。但对于浸膏得率来说，各影响因素的主次顺序为：C>D>B>A，即影响因素最大的是加水量，最小的是浸泡时间，最优组合为A1B3C1D2。

表2 正交试验结果(n=3)

续表

以柚皮苷为考察指标时，D、B因素对结果有统计学意义(P<0.05)，其余2个因素没有统计学意义(见表3)，与上述直观分析的结论一致。当以浸膏得率为考察指标时，除因素A外，其他3个因素均有统计学意义(P<0.05)(见表4)，与直观分析结论中A为影响最小的因素相一致。

表3 柚皮苷含量方差分析表(n=3)

表4 浸膏得率方差分析表(n=3)

2.3 多元非线性回归分析 回归方程以及优化计算结果，见表5、表6、表7。非线性方程中各变量显著性检查结果见表8、表9。由表5的结果可以看出，2个指标的线性方程调整后相关系数在0.7左右，无论是F值还是P值都无法满足显著性检验要求，方程拟合度不高，预测性差。可以证明此次试验结果非简单的线性关系，需考虑使用非线性回归分析。

经过非线性回归分析，结果见表6。可见2个指标的多元非线性回归方程的调整后相关系数都接近1，P值小于0.05，且Durbin-Watson统计量趋近于2，说明方程拟合度高，且残差间无明显相关性。由表7的各变量的显著性检查结果可以看出，柚皮苷回归方程中，各因素P值均小于0.05，统计结果又显著性差异，包括单因素、因素二次项和交互项。其中X1×X1的P值接近0.05，这与方差分析中A因素显著性不强结果一致。由表9的各变量的显著性检查结果可以看出，浸膏得率回归方程中，各因素P值均小于0.05，统计结果有显著性差异。柚皮苷含量与B、C因素有显著的关系，且其他各因素的相互作用对柚皮苷的提取存在一定的影响，其最佳试验条件见表7。另外从表7可知浸膏得率优化得到的最佳试验条件，除浸泡时间外，与前文中直观分析所得优化条件A1B3C1D2基本一致。

表5 多元线性回归分析表

表6 多元非线性回归分析表

表7 最佳试验优化分析结果

表8 柚皮苷含量非线性回归方程各变量显著性检查结果

表9 浸膏得率非线性回归方程各变量显著性检查结果

综合考虑柚皮苷含量和浸膏得率2个指标的优化条件，同时考虑到柚皮苷在处方中的重要性和生产过程中的实际情况，采取无需提前浸泡，加7倍量的水提取2次，每次80 min的试验方案。

2.3 验证试验 验证试验结果见表10。

表10 优选工艺验证结果(%，n=3)

3 讨论

考虑到本制剂为口服糖浆剂，浸膏越多，对制剂的澄清度和稳定性的控制难度越大，故优选提取工艺在提高柚皮苷含量的同时，降低浸膏得率。

对比直观和方差分析与多元非线性回归分析的结果，2者之间有部分的相似，同时也存在一定的差异。分析其原因，可能在于直观和方差分析没有考虑到各变量的相互作用[14-15]，从非线性回归方程中各变量的显著性可以看出，各因素间的相互作用对实验指标有显著性影响。同时直观方差分析只能定性分析各因素的主次关系，不能给出最优化条件下各影响因素的准确取值，对结果无法给出准确预测。如文中所述，本文的最优工艺中7倍量水和80 min的提取时间都不是原正交试验设计的条件，而是通过回归方程计算得来，验证试验表明结果一致，可以作为生产设计的选择依据。

通过文中的试验，可以得知对于处方较为复杂的中成药制剂来说，由于药材种类多，药材中的性质迥异成分更多，无法避免的存在相互影响的因素，如果用线性描述将丢失大量信息，甚至得出错误结论，这时可以用非线性回归方法分析。结果表明多元非线性回归分析法效果明显优于线性回归，有较高的实用价值。

综上所述，苏杏二陈糖浆的最优水提工艺为: 无需提前浸泡，加7倍量的水提取2次，每次80 min。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部[S].2010 年版.北京：中国医药科技出版社，2010：69-70.

[2] 伍虹，沈勇根，蔡志鹏，等.化橘红挥发油化学成分GC-MS分析[J].农产品加工，2011，244(5)：90-91.

[3] 邓少东，王莲婧，林励，等．化橘红黄酮类成分UPLC与HPLC指纹图谱的比较研究[J].中草药，2013，44(9)：1195-1198.

[4] 董宏坡，江明树，朱伟杰．化橘红多糖对小鼠的免疫调节作用[J].中成药，2010，32(3)：491-493.

[5] 黄飞龙，马三梅．化橘红主要有效成分的分析方法[J].安徽农学通报，2007，13(13)：26-28.

[6] 孟军华，张盛，黄荣增，等.桑杏汤的水提工艺研究[J].时珍国医国药，2013，24(12)：2901-2902.

[7] 刘小莉，姚仲青，秦昆明，等．正交实验结合HPLC指纹图谱优选散瘀镇痛颗粒水提工艺[J].中成药，2013，35(3)：495-499.

[8] 李习平，杨梓懿，石继连，等.正交试验法优选知母水处理工艺[J].湖南中医药大学学报，2010，30(3)：45-47.

[9] 王洁贞，李颖琰，陈冠民．医学统计学[M]．郑州：郑州大学出版社，2002：137-144.

[10] 韦博成，万方焕，朱宏图.非线性回归分析及其应用[M].北京：中国统计出版社，2006：86-88.

[11] 施旭光，王沛坚.非线性回归分析不同剂量配伍对乌头汤中主要化学成分的影响[J].中药新药与临床药理，2009，20(1)：55-58.

[12] Fan XJ, Liu Q,Zhen P,et al.Stepwise multiple regressions application in liposome orthogonal experiments[J].J Chinese Pharm Sci,2007,16 (2):96-100.

[13] 王政， 魏莉.利用SPSS软件实现药学实验中正交设计的方差分析[J].数理医药学杂志，2014，27(1)：99-102.

[14] 乔克林， 吕佳.方差分析与回归分析之比较[J].延安大学学报(自然科学版)，2009，28(2)：34-36.

[15] 陈凤英.二、三水平正交试验广义方差分析的探讨及应用[J].天津师范大学学报(自然科学版)，2013，33(3)：12-15.

(编校：王冬梅)

Comparison and analysis on water extraction process of the preferred SuXingErChen Syrup by orthogonal test and multivariate nonlinear regression analysis

JI Zhu-wa1Δ, JIN Hui-fang2

(1.Major of Pharmaceutical Preparations, Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo 315100, China; 2.Department of Acupuncture and Moxibustion, Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou 310003, China)

ObjectiveTo select optimum water extraction process of SuXingErChen Syrup by orthogonal test and multivariate nonlinear regression analysis.MethodsNaringin was extracted by water, Used the naringin content and extraction rate of extractum as indexes.Based on the orthogonal test and multivariate nonlinear regression analysis to make sure the best way for extracting naringin from SuXingErChen Syrup.ResultsThe optimal conditions of water extraction process was that the herbs were added seven times the amount of water without infiltration,extracted two times with 80 min each time,which was selected by multivariate nonlinear regression analysis.ConclusionThe process of water extraction for the preferred Su XingErChen Syrup is exact, high effective and suitable for production needs.

SuXingErChen Syrup; naringin; multivariate nonlinear regression analysis; water extraction; orthogonal test

计竹娃，通信作者，女，硕士，讲师，研究方向；药物制剂新剂型，E-mail：1513103398@qq.com。

R284.2

A

1005-1678(2015)10-0147-04