过表达VHA－c1基因对拟南芥根长及ABA与糖响应的影响

苏 杰，郭荣起，姜树原，邸 娜，李国婧，王瑞刚＊

（1 内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古土右旗014109；2 内蒙古农业大学 生命科学学院，呼和浩特010018；3 内蒙古呼伦贝尔市农业科学研究所，内蒙古牙克石162650；4 包头医学院中心实验室，内蒙古包头014040；5 河套学院，内蒙古临河015000）

液泡H＋－ATPase（V－ATPase），最早发现于液泡，存在于真核细胞各种分泌系统膜上［1］，是一种由13个亚基组成的寡聚酶，分V1和V02个结构域。V1域突出膜外，由A～H 共8个亚基构成。V0域镶嵌于膜内，由a、c、c″、e和d共5个亚基组成［2］。

在对V－ATPase各亚基的研究中，c亚基倍受关注，它与酵母的Vma3p和F－ATPase的c亚基同源［1］。它的分子量约为16kD，是形成膜V0域的主要组件；同时，它是质子转运的通道，与H＋转运有关［3－4］。此 外，c亚 基 对V1－V0的 装 配 也 是 必 不 可少的。缺少c亚基时，酵母突变体能够合成V1域，但不能被组装到膜上。此外，c亚基是细胞通讯中间隙联结的部分，是神经递质释放介导体的组分，也是某种罕见的病毒癌基因产物的靶蛋白［3］。这些结果表明c亚基在细胞信号转导过程中起重要作用。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）V－ATPase 的c亚基 属 于 多 基 因 家 族（VHA－c），由VHA－c1（At4g34720）、VHA－c2 （At1g19910）、VHA－c3（At4g38920）、VHA－c4 （At1g75630）和VHA－c5（At2g16510）共5个同源基因编码，它们编码的脂质蛋白分子量约为16kD［2，4］。研究表明，光照、外源激素和营养等非生物胁迫与拟南芥V－ATPase c亚基基因表达调节有关。邸娜［5］证实VHA－c 基因对外源激素、高盐、渗透胁迫及水分胁迫有响应。Padmanaban等［6］的研究表明，VHA－c 基因对细胞扩增起重要作用，尤其对根冠作用更加明显。郭荣起［7］研究发现VHA－c1 沉默纯合体的根和下胚轴长度短于对照。于秀敏等［8］的研究也揭示VHA－c2、VHA－c3和VHA－c5均可被4 ℃低温和光照促进表达。这些结果都证明了拟南芥V－ATPase c亚基在植物响应非生物胁迫过程中可能具有重要作用。

为了更深入地了解拟南芥VHA－c 基因的功能，本实验构建了VHA－c1基因的过表达载体转化野生型拟南芥，并对VHA－c1基因的过表达纯合体进行了暗培养、ABA 处理和糖处理，为进一步探明VHA－c 基因在植物非生物胁迫方面的抗性机制提供了初步的理论依据。

1 材料和方法

1．1 材 料

拟南芥野生型Columbia生态型（Col－0）由内蒙古农业大学植物分子生物学实验室提供。培养条件：22 ℃，16h光照／8h黑暗，相对湿度约60%。

1．2 方 法

1．2．1 VHA－c1 基因过表达载体的构建及农杆菌转化 采用CTAB 法［9］提取拟南芥基因组DNA。然后以拟南芥基因组DNA 为模板，扩增VHA－c1目的片段，PCR 引物的设计为。为了方便构建VHA－c1基因的表达载体，在2条引物的5′－端分别引入了KpnⅠ和SalⅠ的酶切位点。PCR 反应条件为：98 ℃预变性1 min；然后98 ℃变 性10s，58 ℃退 火30s，72 ℃延 伸2 min，共30个循环；最后72 ℃延伸6min。

将PCR 产物纯化和凝胶回收，再连接到pGMT 载体（天根公司）进行测序。测序证明序列正确后，利用KpnⅠ和SalⅠ酶切pGM－T－c1载体获得目的片段，与利用相同酶切的pCHF3 载体连接并转化大肠杆菌DH5α，获得目标过表达载体pCHF3－c1。将过表达质粒载体pCHF3－c1 用电击法［10］转化到农杆菌GV3101细胞中，取50μL 转化产物涂于含25μg／mL Gent和100μg／mL Spect固体培养基上，28 ℃培养36～48h，筛选阳性克隆。

1．2．2 拟南芥的转化及转基因纯合体的获得 拟南芥的转化采用浸花法［11］，转化后将植株在正常条件下继续培养3～4周，收取成熟种子。将种子播种于含30μg／mL Kan的1／2 MS选择培养基中，22℃培养，10～12d后挑选阳性植株，待其成熟后分单株收取种子（T1代）；T1代种子按单株种于含30 μg／mL Kan的选择培养基上，选择有3∶1性状分离的株系，将绿苗移至蛭石上培养，单株收取种子（T2代）；T2代种子按单株在含30μg／mL Kan的培养基上继续筛选，不再分离的即为纯合体株系，用于本次实验的各项分析。

1．2．3 VHA－c1 转基因植物半定量RT－PCR 鉴定 提取野生型和过表达转基因纯合体拟南芥的总RNA［12］，参照TakaRa公司反转录试剂盒说明书反转录得到cDNA。再以cDNA 为模板，对actin（At3g12110）和VHA－c1基因进行PCR 扩增，actin引物为actin－RT－F（5′－ATGGCAGATGGTGAAG－ACATTCAG－3′）和actin－RT－R（5′－GAAGCACTTCCTGTGGACTATTGA－3′），VHA－c1引物为c1－RT－F（5′－GATTTAAGATCTCAGATACAAAACTCCGAC－3′）和c1－RT－R（5′－TCCTACAATAAGCCCGTAAAGAGCAAGCGC－3′）。半定量RT－PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，25个循环；最后72 ℃延伸5min［6］。将PCR 产物于1．5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析（Syngene公司凝胶成像仪）。

1．2．4 VHA－c1 转基因纯合体的暗培养 转基因纯合体和野生型拟南芥种子同时种在1／2MS［13］培养基上，暗培养5d后，统计根的长度［6］。

1．2．5 不同浓度ABA 处理VHA－c1转基因纯合体（1）转基因纯合体和野生型拟南芥种子同时种在1／2 MS培养基中，4℃春化3d，22℃、16h光照／8h黑暗条件下培养48h后，转移至含有不同浓度ABA（0、4、8和12μmol／L）的1／8MS的方平板上，竖直放置，16h 光照／8h 黑暗培养4d，统计主根的长度。（2）转基因纯合体和野生型拟南芥种子同时种在含有不同浓度ABA（0、0．5、1和2μmol／L）的1／2 MS培养基中，4 ℃春化3d，再于22 ℃、16h光照／8h黑暗条件下培养2d，统计萌发率［14］。

1．2．6 不同浓度糖处理VHA－c1转基因纯合体 转基因纯合体和野生型拟南芥种子同时种在含有0、4%、5%和6%蔗糖或葡萄糖的1／2 MS 培养基中，4 ℃春化3d，再于22 ℃、16h光照／8h黑暗条件下培养3d，统计其萌发率［15－16］。

2 结果与分析

2．1 VHA－c1基因过表达载体构建和农杆菌转化

以拟南芥基因组DNA 为模板，扩增VHA－c1基因的目的片段，扩增产物的片段为1 060bp（图1），PCR 产物与pGM－T 载体连接后，命名重组质粒为pGM－T－c1，转化大肠杆菌DH5α。挑取白色单菌落，进行PCR 扩增及酶切鉴定，送上海生工生物技术有限公司测序。验证目的片段正确后，将阳性质粒pGM－T－c1和表达载体pCHF3用KpnⅠ和SalⅠ双酶切。连接酶切产物获得重组质粒pCHF3－c1，转化大肠杆菌DH5α，提取阳性克隆的质粒，进行KpnⅠ和SalⅠ的双酶切电泳。电泳结果与预期结果一致（图2）。由此可见，过表达VHA－c1 基因的重组质粒pCHF3－c1构建成功。用电击法将重组质粒pCHF3－c1转化农杆菌GV3101，挑选培养在含Spect和Gent两种抗生素的LB固体培养基上的单克隆，进行菌落PCR 检测呈阳性，证明重组质粒pCHF3－c1已经转入农杆菌GV3101中。

2．2 拟南芥VHA－c1转基因植株的筛选

重组质粒pCHF3－c1经农杆菌介导转入野生型拟南芥。经筛选获得T1代转基因株系22个，经进一步筛选，最终获得7个T2代转基因纯系（过表达纯合株系），这7个株系分别为c1－3－8、c1－9－1、c1－13－3、c1－14－6、c1－16－4、c1－20－9、c1－26－13。

提取野生型（WT）拟南芥和VHA－c1过表达纯合体总RNA，用半定量RT－PCR 进行检测（图3）。将WT 的VHA－c1转录水平定为100%，过表达纯合 体 中c1－13－3 和c1－14－6 的mRNA 表 达 水 平 较强；c1－3－8、c1－9－1、c1－16－4、c1－26－13的mRNA 表达水平居中；c1－20－9 的mRNA 表达水平较弱。

图1 VHA－c1目的片段的PCR 扩增M．DL2000；下同Fig．1 PCR amplification of VHA－c1gene M．DL2000；The same as below

图2 重组质粒pCHF3－c1的酶切鉴定Fig．2 Identification of the recombinant pCHF3－c1 plasmid digested with KpnⅠand SalⅠ

图3 VHA－c1转基因纯合体mRNA 表达水平WT．野生型（对照）；1～7分别是转基因株系c1－3－8、c1－9－1、c1－13－3、c1－14－6、c1－16－4、c1－20－9、c1－26－13Fig．3 The transcript level of VHA－c1gene in the overexpression transgenic plants WT．Wild type（control）；1－7．Transgenic plants c1－3－8，c1－9－1，c1－13－3，c1－14－6，c1－16－4，c1－20－9and c1－26－13，respectively

2．3 VHA－c1转基因纯合体的根变短

在 正 常 光 照 培 养 下（16h 光 照／8h 黑 暗），VHA－c1过表达纯合体与野生型拟南芥未见明显差异。根据Padmanaban 等［6］研 究 方 法，将VHA－c1过表达纯合体和对照种子，暗培养5d后测量根长度（图4）。结果（图6）显示，6个株系的平均根长比对照分别短12%、6%、12%、15%、3%和7%，且c1－14－6与对照之间根长的差异达到显著水平，c1－16－4与对照之间根长的差异达到极显著水平。这些结果表明，在黑暗条件下，VHA－c1基因过量表达抑制了根的生长。

2．4 ABA 处理下VHA－c1转基因纯合体主根伸长和种子萌发的变化

2．4．1 VHA－c1 转基因纯合体主根伸长和子叶的变化 不同浓度ABA 处理后，4个株系的VHA－c1转基因纯合体主根相对伸长量大于对照；随着ABA浓度的增加，过表达纯合体和对照植株主根生长被抑制的程度均增加，同时子叶的黄化程度增加，且VHA－c1转基因株系子叶的展开程度要高于对照（图5，以c1－3－8为例）。在4μmol／L ABA 浓度下，4个株系主根的相对伸长量平均比对照分别增加9%、13% 、13%和24%；在8μmol／L ABA 浓度下，分别增加17%、12% 、8%和6%；在12μmol／L ABA 浓度下，分别增加8%、6% 、4%和1%。部分ABA 浓度处理下主根的伸长量与对照之间的差异达显著或极显著水平（图7）。

2．4．2 VHA－c1 转基因纯合体种子萌发率的变化不同浓度ABA 处理VHA－c1 转基因纯合体，结果显示，当ABA 浓度大于2．0μmol／L 时，所有种子的萌发几乎全部被抑制；当浓度介于0～2．0μmol／L时，所有VHA－c1过表达纯合体和野生型种子的萌发都受到抑制，且随着ABA 浓度的增大，种子萌发率 均 下 降。 在 不 同 ABA 浓 度 下，所 有VHA－c1转基因株系的萌发率均大于野生型；0．5 μmol／L ABA时，7 个株系的萌发率比野生型增加30%、28%、32%、22%、30%、15% 和20%；1．0 μmol／L ABA，萌发率增加量分别为76%、79%、40%、43%、50%、69%和55%；在2．0μmol／L ABA浓度下，萌发率增加量分别为58%、12%、55%、48%、48%、24%和23%，大部分株系与WT 之间的差异达到显著或极显著水平（图8）。以上结果表明，VHA－c1基因的过表达降低了根、子叶和种子对ABA 的敏感性。

图4 在暗培养条件下2个VHA－c1转基因纯合体根的表型Fig．4 The root phenotype of two VHA－c1transgenic homozygous lines grown in dark

图6 暗培养条件下VHA－c1不同转基因纯合体株系的根长比较c1的1～6分别为c1－3－8、c1－9－1、c1－14－6、c1－16－4、c1－20－9、c1－26－13；＊和＊＊分别表示转基因株系与野生型间在0．05和0．01水平存在显著性差异；下同Fig．6 Comparison of the root length of different VHA－c1 transgenic homozygous lines grown in dark 1－6correspond to six transgenic homozygous lines c1－3－8，c1－9－1，c1－14－6，c1－16－4，c1－20－9and c1－26－13，respectively；＊and＊＊indicate significant difference between transgenic homozygous lines and wild types at 0．05and 0．01 level，respectively；The same as below

图7 不同浓度ABA 处理后VHA－c1转基因株系主根相对伸长量Fig．7 Relative taproot growth of VHA－c1 transgenic homozygotes with the treatment of different concentrations of ABA

图8 不同浓度ABA 处理下VHA－c1纯合体种子萌发率Fig．8 The germination rate of VHA－c1 transgenic homozygotes with the treatment of different concentrations of ABA

2．5 不同浓度糖处理下VHA－c1转基因纯合体种子萌发率的变化

许多研究发现，植物响应ABA 的生理过程与糖有关，于是我们接着对过表达纯合体进行了糖处理。在浓度为4%、5%和6% Glc（葡萄糖）处理下，有5个株系的种子萌发率均高于WT（图9，A），而在浓度为4%、5%和6%Suc（蔗糖）处理下，有4个株系的种子萌发率均高于WT（图9，B）。

图9 不同浓度葡萄糖（A）和蔗糖（B）处理下VHA－c1转基因株系种子萌发率Fig．9 The germination rate of VHA－c1transgeneic homozygotes with the treatment of different concentrations of glucose（A）and sucrose（B）

3 讨 论

3．1 VHA－c1在细胞扩展中的可能作用

V－ATPase某 些 亚 基（如A［17］、C［18－19］和E［20］）表达量的变化，影响了细胞扩展。其机理是V－ATPase利用液泡中ATP的γ－磷酸基团裂解时所释放的能量，将质子泵到液泡腔中，产生H＋电化学梯度，使液泡酸化，为物质运输提供能量，从而影响膨压和细胞扩增［21］。

对于V－ATPase c亚基，Padmanaban等［6］已通过dsRNA 干扰发现拟南芥vha－c1突变株在暗培养下根和下胚轴长度都变短，揭示VHA－c1在细胞扩展中起重要作用。本实验发现，暗培养下的拟南芥VHA－c1过表达纯合体的根变短，再次证实VHAc1在细胞的扩展中起作用。至于根为何变短，推测可能是由于VHA－c1 的上游调控区存在光敏感元件AE－box、GATA 等，黑暗信号可能直接或间接影响VHA－c1的过量表达，进一步影响V－ATPase活性，使得细胞扩展时质子的转运及液泡的酸化困难，使物质运输时供能受阻。至于是主根分生区变短还是根细胞伸长受抑制，还有待于在细胞层次上进一步验证。

3．2 VHA－c1可能参与ABA 和糖介导的信号转导途径

ABA 是一种调节植物生长发育的激素，参与植物生长过程，并且广泛存在于各种植物诸多生理活动中，如参与种子休眠、叶及根的伸展以及叶片脱落等。Tsinatis等首次报道了ABA 诱导V－ATPase c亚基的表达［22］。研究发现，对外源ABA 有响应的植株其V－ATPase活性及H＋转运活性增加［22－23］。本实验对获得的过表达纯合体的种子和幼苗进行ABA 处理后发现，VHA－c1的过表达导致转基因纯合体种子萌发、主根伸长和子叶的扩展对ABA 的抑制不敏感。我们推测很可能是由于VHA－c1 基因的过量表达影响了V－ATPase的活性及H＋转运活性，进而影响了植物在种子萌发和生长过程中对ABA 的响应和转运。

有研究发现，植物响应ABA 的生理过程与糖有关。Chen等［14］发现，对ABA 不敏感的突变体hy5在种子萌发和幼苗生长方面对糖的抑制也不敏感，可能是由于糖处理减弱了种子或幼苗对ABA的响应。Finkelstein等［24］将野生型和对ABA 不敏感（abi）的拟南芥种子进行萌发实验后发现，低浓度的葡萄糖、蔗糖或果糖影响ABA 的抑制作用。本实验对过表达纯合体进行了糖处理，结果显示：过半数的VHA－c1过表达纯合体株系的种子在用葡萄糖和蔗糖处理后，萌发率较野生型高。综合ABA和糖处理的结果，VHA－c1的过表达导致种子的萌发对外源ABA 和糖处理都不敏感，至于在种子萌发时，ABA 和糖信号怎样介导种子萌发的信号转导，以及VHA－c1 的过量表达怎样影响了V－ATPase的活性，从而降低了种子对ABA 和糖的敏感程度，还有待于进一步的研究证实。

综上所述，本研究获得了拟南芥VHA－c1过表达纯合体，对其进行暗培养、ABA 处理和糖处理，发现其表型与野生型不同，为进一步研究VHA－c1基因在植物生长发育、激素响应和信号转导过程中的功能奠定了基础。

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