成熟玉米秆组织结构切片方法的比较研究

王 欣，隋方功，初庆刚＊

（1 青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东青岛266109；2 青岛农业大学 资源与环境学院，山东青岛266109）

玉米属于C4作物，具有高光合效率及低CO2补偿点，有巨大的高产潜力；它能高效集约利用光热等资源，在主要粮食作物中平均产量最高；它不仅是高产粮食作物，也是营养丰富的饲料作物和良好的工业原料作物。玉米是高秆植物，在生长发育过程中，如果栽培密度过大或突然遇到大风暴雨的袭击，就可能出现倒伏情况。据统计，倒伏导致玉米减产15%～25%，严重时可达50%，中国每年因倒伏造成玉米的产量损失近100万t［1］。防止倒伏是玉米高产栽培的主要目标之一。为了防止倒伏，越来越多的人关注成熟玉米秆，特别是成熟玉米秆的组织结构特点［2－7］。所以，如何获得高质量的成熟玉米秆组织结构切片就成了一个很重要的问题。成熟玉米秆靠近表皮细胞的基本组织和维管束周围的基本组织均已发育成为机械组织，其细胞壁木质化的程度高，其它的基本组织均为薄壁组织。由于其机械组织和薄壁组织的相间分布特点，成熟玉米秆的软硬程度不均匀。同时，成熟玉米秆表皮细胞外切向壁含有大量硅质，也对切片造成很大影响［8］。由于成熟玉米秆这种材料的特殊性，制作成熟玉米秆组织切片十分困难［3］。尽管植物组织切片方法很多（徒手切片法，滑走切片法，冰冻切片法，石蜡切片法，薄切片法等），但是，哪一种方法适用于成熟玉米秆组织结构切片，目前的报道还没有给出合适的方法。本研究在这方面进行了一些探索。

1 材料和方法

1．1 材 料

供试材料为‘郑单958’玉米杂交种，取其成熟期健壮秆基数第三节间。

1．2 方 法

1．2．1 材料固定 将茎秆材料用FAA 固定液固定、抽气后在4℃冰箱中保存。

1．2．2 材料去硅和软化 材料固定后，经过梯度复水，使用15%的氢氟酸水溶液去硅5～7d，如果需要软化，在去硅后，用蒸馏水冲洗3次，使用10%乙二胺软化7d。

1．2．3 薄切片脱脂 获得薄切片后，用NaOH 无水乙醇饱和溶液脱脂3～5 min，然后清水冲洗，在40 ℃烘箱烘干备用。

1．2．4 制片 徒手切片法选用固定后去硅的材料，使用吉列双面刀片做徒手横切片，厚度大约20μm，用番红－固绿染色。冰冻切片法选用固定后去硅的材料，采用冰冻切片机（Microm HM 525）在－25℃冷冻切片，切片厚度为20μm，用苯胺蓝染色。石蜡切片法选用固定后先去硅后软化的材料，采用常规石蜡法制片，厚度8～12μm。薄切片法选用固定后去硅的材料，采用SPURR 树脂配方，用Leica EM UC6切片机切片，厚度为1μm，用甲苯胺蓝染色。

1．2．5 观察 徒手切片、冰冻切片、薄切片观察用LeicaDM 2500万能显微镜，观察拍照。薄切片脱脂后采用扫描电子显微镜（JEOL 7500F）扫描观察。

2 实验结果

2．1 徒手切片法

切片厚度大约在20μm，玉米秆切片整体图完整清晰（图版Ⅰ，1、2），表皮下每一个维管束结构完整清晰，适合低倍、高倍物镜观察。表皮下维管束在高倍数下图像清晰，能够清晰看到维管束周围厚壁细胞的层数（图版Ⅰ，3）。

2．2 冰冻切片法

切片厚度20μm。玉米秆切片整体图完整清晰（图版Ⅰ，4、5），表皮下每个维管束结构完整清晰。表皮下维管束在高倍数下图像清晰，能够清晰地看到维管束周围厚壁细胞的层数（图版Ⅰ，6）。

2．3 石蜡切片法

成熟玉米秆如果不软化或软化时间不够，材料硬度依然很大，材料在切片过程中碎化成粉末，无法进行后面的染色封片拍照；如果充分软化，材料中非木质化加厚的部分由于软化过度，整个材料会分散开，无法进行包埋切片。采用石蜡切片法无法获得成熟玉米秆的组织切片。

2．4 薄切片法

图片的清晰度很高，切片完整，切片厚度1μm。玉米秆切片整体图完整清晰（图版Ⅱ，1、2），能够看到表皮下每一个维管束。每个维管束结构完整，更加清晰。表皮下维管束在高倍数下图像清晰，能够清晰地看到维管束周围厚壁细胞的层数（图版Ⅱ，3）。

通过对薄切片脱脂后进行电镜扫描，获得高倍数放大的图像。表皮及表皮下机械组织图像完整清晰，能够清晰看到机械组织的层数（图版Ⅱ，4）。表皮下维管束在高倍数下图像清晰，能够清晰地看到维管束下厚壁细胞的层数（图版Ⅱ，5）。维管束下厚壁细胞的图片也非常清晰，可以测量细胞壁的厚度、细胞腔大小等数据（图版Ⅱ，6）。

3 分析与讨论

玉米秆表皮有硅质细胞，内含质地坚硬的硅质颗粒，表皮细胞外切向壁硅化，这些硅质的存在对切片刀的损害极大，会使切片产生划痕、碎裂，影响切片质量。所以，切片前必须去硅。对禾本科植物进行切片观察，不管采用什么切片方法，都应该首先去硅后再进行后续的实验。在本实验中，采用15%的氢氟酸水溶液浸泡材料5～7d，能够有效去除茎秆表面的硅质。

由于玉米不像乔木等木本植物材料内外木质化程度差别不大，成熟玉米秆表皮下机械组织和维管束周围的机械组织木质化程度高，其它的基本组织细胞为薄壁细胞，使用物理或化学的软化方法，难以达到合适的软化程度［9］。

徒手切片法的优点是操作简单，不需要机械设备，由于没有经过早期的化学处理，比较能保持活体的情况，在组织化学上及许多一般的结构观察上常常得到应用。材料不能太大，一般以材料断面不超过5mm×5mm 为宜。切片最重要的是平而薄，该方法对于成熟玉米秆比较合适，但是该方法切片厚度较厚而且厚度不好控制，厚的切片清晰度不好。

冰冻切片法是利用滑走切片机，装上特别设计的冷冻器而进行切片。此种方法可以适用于含水较多的材料［10］，成熟玉米秆的含水量较低，表皮细胞壁硅化和硅质细胞对刀的损害较大，容易划伤材料。所以成熟玉米秆在采用冰冻切片法获取组织切片前一定要去除材料表面的硅质。这种方法对于成熟玉米秆不是很适合，如果要用这种方法，一定要使组织材料切口小于3 mm×4 mm。切片的材料面积较小，不利于观察统计。采用冰冻切片法可以获得成熟玉米秆组织切片。

石蜡切片法不能获得合格的成熟玉米茎秆切片。成熟玉米秆木质化的机械组织非常发达，材料经过高浓度酒精和二甲苯处理后会变得异常硬而脆，材料硬度远高于石蜡，而且石蜡切片所用的金属刀硬度也很难切割材料，所以很难切出完整的切片。茎秆软化后再进行石蜡切片也有很大难度，由于成熟玉米秆机械组织和基本组织（薄壁组织）相间分布，机械组织软化成功时，基本组织细胞出现破裂。采用石蜡切片法很难获得成熟玉米秆结构组织切片。尽管有采用常规石蜡制片法研究成熟玉米秆的报道，但从图示中可以看出维管束周围的机械组织并没有发育［11］。机械组织发达的玉米秆无法采用石蜡切片获得高质量的切片。

成熟期玉米秆薄切片在切片前需要经过3～5d的去硅后才可以切片，否则对刀和材料的损害都非常大［12］。薄切片法可以获得清晰度很高的切片，但是薄切片对于材料大小要求较严格，一般材料断面低于1mm2。成熟玉米秆较粗，维管束多而散生，采用这种方法一般只能切出一个完整的维管束，获得的组织切片较小，不利于玉米秆结构大范围的观察。获得的薄切片也可以通过NaOH 无水乙醇的饱和溶液去除材料中的树脂、干燥后，在放大倍数更大的扫描电子显微镜下扫描观察。总体而言，薄切片可以获得较高质量的成熟玉米秆局部组织切片，特别是适合研究材料结构范围不大，但是放大倍数要求较高时使用。

综上所述，徒手切片法、冰冻切片法和薄切片法可以获得合格的成熟玉米秆的组织结构切片，石蜡切片法不能获得合格的成熟玉米秆的组织结构切片。徒手切片法是最适合成熟玉米秆组织结构观察研究的制片方法。

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PC．薄壁细胞；S．厚壁组织图版Ⅰ 1．成熟玉米秆徒手切片整体图；2．成熟玉米秆局部徒手切片图；3．成熟玉米秆维管束徒手切片图；4．成熟玉米秆冰冻切片整体图；5．成熟玉米秆局部冰冻切片图；6．成熟玉米秆维管束冰冻切片图。PC．Parenchyma cell；S．SclerenchymaPlateⅠ Fig．1．Whole figure of mature maize stalk with freehand section；Fig．2．Freehand slice figure of partial mature maize stalk；Fig．3．Freehand slice figure of mature maize stalk showing vascular bundle；Fig．4．Overall figure of mature maize stalk with frozen section；Fig．5．Partial figure of mature maize stalks with frozen section；Fig．6．Mature maize stalk vascular bundle with frozen section．

PC．薄壁细胞；S．厚壁组织图版Ⅱ 1．成熟玉米秆薄切片整体图；2．成熟玉米秆局部薄切片图；3．成熟玉米秆维管束薄切片图；4．成熟玉米秆表皮扫描图；5．成熟玉米秆维管束扫描图；6．成熟玉米秆维管束周围机械组织扫描图。PC．Parenchyma cell；S．SclerenchymaPlateⅡ Fig．1．Mature maize stalk overall figure with thin section；Fig．2．Mature maize stalk partial figure with thin section；Fig．3．Mature maize stalk showing vascular bundles with thin section；Fig．4．Epidermis scan of mature maize stalk；Fig．5．Vascular bundle scan of mature maize stalk；Fig．6．Mature maize stalk mechanical structure around vascular bundles．