浅析马传贫琼脂扩散试验方法及影响因素

李亚琴 祝常芬

摘要：马传染性贫血病（Equine Infectious Anemia， EIA，以下简称马传贫），是由反转录病毒科慢病毒属马传贫病毒引起的马属动物传染病。我国将其列为二类动物疫病。本病只感染马属动物，其中，马最易感，骡、驴次之，且无品种、性别、年龄的差异。病马和带毒马是主要的传染源。主要通过虻、蚊、刺蝇及蠓等吸血昆蟲的叮咬而传染，也可通过病毒污染的器械等传播。多呈地方性流行或散发，以7～9月份发生较多。在流行初期多呈急性型经过，致死率较高，以后呈亚急性或慢性经过。本文主要是作者在做马传贫琼扩试验（AGID）过程中的一些方法经验，仅供参考。

关键词：马传贫；试验步骤；影响因素

一、试验步骤

（一）、琼脂板制备

1、 PBS液制备

Na2HPO4.12H2O 2.9克

KH2PO4 0.3克

NaCl 8.0克

蒸馏水加至 1000毫升

2、 琼脂板

纯化琼脂糖 10克

迭氮钠 0.2克

加入到配置好的1000毫升PBS液中。

加热后煮沸10分钟，待琼脂完全融化后，倒板，琼脂板的厚度为3-4mm，凝固后倒置于4℃冰箱中保存备用，凝固冷却后也可以直接打孔。

（二）、打孔

反应孔现用现打。打孔器为外径5mm直径的薄壁型金属打孔器。在坐标纸上画好七孔型图案（如示意图一、图二）。把坐标纸放在带有琼脂板的平皿下面，照图案在固定位置上用金属管打孔，孔直径5mm，孔距3mm，最后挑孔，将切下的琼脂块取出。

（三）、封板

将挑孔后的琼脂板放入煮沸的水中封板15秒左右取出，观察琼脂板封板后是否有气泡，有大气泡的建议淘汰，防止加样时候漏孔。

（四）、抗原

检验用抗原按马传贫琼扩抗原生产制造及检验规程进行生产。

（五）、血清

检验用标准阳性血清：能与合格抗原在12小时内产生明显致密的沉淀线的马传贫血清，做8倍以上的稀释仍保持阳性反应者为宜，冻结保存，使用时要注意防止散毒。

受检血清：来自受检马属动物的不腐败的血清，勿加防腐剂和抗凝剂。

（六）、编号、加样

在琼脂板上端写上日期及编号等，当受检血清较少时采用打孔示意图一方法。在示意图一中⑦孔加抗原，①③⑤孔加样品血清，②④⑥加入阳性血清。当受检血清较多时采用打孔示意图二方法，示意图二中①①①……数字号孔分别加入受检样品血清，②孔加抗原，③孔加阳性血清，加至孔满为止。

① ②

⑥ ⑦ ③ （示意图一）

⑤ ④

⑦-抗原，①③⑤-样品，②④⑥-阳性血清

① ① ① ① ① ① ① ① ① ① ① ①

② ③ ② ③ ② ③ ② ③ ② ③ ② ③ ②

① ① ① ① ① ① ① ① ① ① ① ①

（示意图二） ①-样品，②-阳性血清，③-抗原

二、扩散

将加好样的琼脂板放置于室温（18-25℃）反应，24小时后借助灯光观察结果，并记录结果。

三、判定

阳性：抗原与被检血清孔之间出现一条明显的沉淀线，而且与标准阳性血清孔的沉淀线完全融合；或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清的抗原侧偏弯者，此种受检血清判定为阳性。

阴性：抗原与标准阳性之间的沉淀线尖端垂直，受检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或向受检血清孔侧偏弯者，此种受检血清为阴性。

疑似：标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端，似乎向毗邻受检血清孔内侧偏弯，但不易判断时，可将抗原稀释2倍、4倍、6倍、8倍进行复试，最后判定结果。判定结果时，应从不同折光角度仔细观察平皿上抗原孔与受检血清孔之间有无沉淀线。

判断时要注意非特异性沉淀线：被检血清与抗原之间出现两条平行沉淀线，其中一条与标准阳性融合，可能被检血清中有非特异性物质，应将被检血清56-60℃灭能30分钟，再进行试验，观察结果。

四、影响试验因素

（一）、琼脂的质量对试验有一定影响，最好选择纯化琼脂糖（高级琼脂糖）。

（二）、琼脂板是否平整对试验有一定的影响，倒板时候选择平整，底部厚度均匀的玻璃平皿。平皿板不平整倒入的琼脂的厚度也就不均匀，当相邻孔加等量的抗原和阳性血清时，会出现琼脂板薄的一边的孔溢出的现象，不等量反应会使沉淀线偏移，从而对结果判定带来影响。

（三）、打孔是否准确，打孔时，尤其是连孔型，孔与孔的位置不正会使沉淀线偏位；挑孔时，挑破琼脂孔边缘，使渗透度不一致，也会使沉淀线偏位，对结果判定带来影响。

（四）、封板的时间。封板时间不易太长或太短，15秒左右为宜。太长会使琼脂板融化，太短琼脂板没有封好，会出现气泡，加样时会有漏孔现象，不利于观察判定结果。

（五）、反应温度。于室温（18-25℃）反应较为适宜。

参考文献：

[1] 蔡宝祥.家畜传染病学.北京：中国农业出版社

[2] 毕远龙 李松柏.实验兽医血清学诊断技术

[3]马传染性贫血防治技术规范