文心兰浅绿条纹突变体的生理生化及叶绿素荧光特性研究

田韦韦，王彩霞，田 敏，欧阳彤，张 莹

（中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江省林木育种技术研究重点实验室，杭州311400）

文心兰（Oncidiumspp.），又名舞女兰，为兰科（Orchidaceae）文心兰属（Oncidium）多年生草本植物，原产于中美洲和南美洲的热带和亚热带地区［1］。文心兰的花枝长，花小而繁多，花形奇特，颜色艳丽，是一种观赏价值较高的洋兰，被广泛用作切花材料和盆栽观赏。文心兰同其它兰科植物一样，采用传统的分株繁殖方法繁殖系数较低，难以满足市场需求，利用组织培养技术可以加快繁殖速度，实现种苗工厂化生产。在文心兰组织培养过程中，再生植株易出现不同程度的叶色突变，而且这些突变性状能快速地通过组织培养进行无性繁殖应用。

叶色突变通常是由于叶绿素的代谢过程受到影响，导致叶绿素的含量和比例发生改变引起的。叶色突变体作为一种特殊的材料，是研究高等植物光合机制、叶绿素代谢途径和叶绿体遗传发育等方面的理想材料。迄今，国内外已从烟草（Nicotiana tabacumL.）［2］、拟南芥（Arabidospisthaliana）［3］、大 麦（Hordeumvulgare）［4］、水稻（Oryzasativa）［5］、黄瓜（CucumissativusL.）［6］等众多植物中发现、获得并鉴定出大量叶色突变体。然而，有关花卉叶色突变体的报道则较为匮乏，花烛（Anthurium andraeanum）中有花叶、黄化叶、天鹅绒绿叶突变体［7］，大花蕙兰（Cymbidiumhyhridum）中有白色条纹和黄色条纹叶色突变体［8］，菊花（Chrysanthemummorifolium）中有黄绿叶突变体［9］，文心兰（Oncidiumspp.）中有黄化突变体［10］，目前尚未见有关文心兰浅绿条纹突变体的研究报道。作者所在研究组自2005年以拟原球茎诱导途径进行文心兰的组织培养［11］，在组织培养后代中发现了浅绿条纹突变体，此突变体具有较高的观赏价值。本研究以文心兰组培后代中获得的浅绿条纹突变体为试验材料，分析叶片光合色素及叶绿素合成前体物质含量，观察叶绿体的超微结构，测定叶绿素荧光参数，以初步了解其叶色变异的生理基础，为进一步从分子水平揭示其机理奠定基础，并为文心兰叶艺新品种培育提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试材料为本研究组自2005年开始以拟原球茎诱导途径进行组织培养获得的浅绿条纹突变体，该突变体叶片呈现绿色与浅绿色相间的纵条纹，且其突变性状在离体增殖培养过程中保持稳定（图1）。分别选取5株处于同一生长期，长势相对一致，具5～6叶的突变体和正常植株用于试验。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 光合色素含量 光合色素含量的测定参照李合生［12］的方法。选取突变体和正常植株最上部第2片叶片，剪成宽度小于1mm 细丝，混匀后称取0.05g放入试管，加入5 mL 丙酮与无水乙醇混合液（1∶1，V／V）避光浸提至叶片完全变白（24h），测定溶液吸光度A470、A645和A663，共3次重复。

图1 文心兰浅绿条纹突变体的表型Fig.1 Phenotypes of light green stripe mutant of Oncidium

1.2.2 叶绿素合成前体物质含量 选取突变体和正常植株最上部第2片叶片进行叶绿素合成前体物质含量测定。δ－氨基酮戊酸（ALA）含量按照王凌健等［13］方法测定；胆色素原（PBG）、尿卟啉原（UrogenⅢ）和粪卟啉原（CoprogenⅢ）含量参照Bogorod［14］的方法测定；原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）、镁原卟啉Ⅸ（MgprotoⅨ）和原叶绿素（Pchl）含量的测定采用Hodgins等［15］的方法。将正常植株7 种叶绿素合成前体物质含量均设为100%，突变体叶绿素合成前体物质含量以相对于正常植株的百分比表示。

1.2.3 叶肉细胞和叶绿体超微结构 选取突变体和正常植株最上部第2片叶片，切成1mm×3mm小块，置于2.5%戊二醛中4 ℃固定过夜，0.1mol／L磷酸缓冲液冲洗3次，1%饿酸固定2h，再用0.1 mol／L磷酸缓冲液冲洗3次，乙醇梯度脱水，再将样品依次浸入体积比1∶1和1∶3的spurr包埋剂和丙酮的混合液渗透1h和3h，纯spurr包埋过夜，70 ℃聚合过夜，Reichert超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，在JEM－1230透射电镜下观察并拍照。

1.2.4 叶绿素荧光参数 采用M 系列调制叶绿素荧光成像系统Imaging－PAM，测定突变体和正常植株最上部第2片叶片叶绿素荧光参数。测定前，将叶片暗处理20min以上，打开测量光（小于1μmol·m－2·s－1）测定初始荧光（Fo），再由饱和脉冲光（2 800μmol·m－2·s－1）测得暗适应的最大荧光（Fm），随后开启光化光（21μmol·m－2·s－1），当时实荧光达到稳态后关闭光化光，同时打开远红光（持续3～5s），测得光适应条件下最小荧光（Fo′）和最大荧光（Fm′）［16－18］。PSⅡ最大光化学效率（Fv／Fm）、PSⅡ的实际利用量子产额（ΦPSⅡ）、光化学淬灭系数（qP）和非光化学淬灭系数（NPQ）等荧光参数值由系统自动计算生成。

1.3 数据处理

数据采用DPS 3.01软件进行方差分析及显著性检验（LSD 法），利用Microsoft Excel 2003绘图。

2 结果与分析

2.1 文心兰突变体与正常植株叶片光合色素含量比较

文心兰浅绿条纹突变体叶片的3 种光合色素（叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素）的含量及其比值均显著低于正常植株（表1）。其中，突变体叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量比正常植株分别显著减少了37.1%、34.0%和30.8%，Chl a／Chl b 和Chl／Car分别减少了5.4%和10.0%。表明文心兰突变体叶片呈现浅绿条纹与叶绿素含量下降有关。

2.2 文心兰突变体与正常植株叶片叶绿素合成前体物质相对含量比较

如图2所示，文心兰浅绿条纹突变体叶片ALA、PBG、Urogen Ⅲ和Coprogen Ⅲ含量均高于正常植株，分别为野生型的113%、135%、120%和139%；而其Proto Ⅸ、Mg－proto Ⅸ和Pchlide含 量却不同程度地比正常植株降低，降低幅度分别为38%、28%和36%。说明文心兰突变体叶绿素生物合成途径受阻，受阻位点位于叶绿素合成前体物质含量变化的拐点处，即从CoprogenⅢ到ProtoⅨ的转化步骤。

2.3 文心兰突变体与正常植株的叶肉细胞和叶绿体超微结构比较

利用透射电镜对文心兰浅绿条纹突变体和正常植株叶片的叶肉细胞、叶绿体超微结构进行比较观察，结果表明突变体与正常植株叶绿体结构存在较大的差异。其中，正常植株叶绿体呈纺锤形（图3，A），基粒数目多且排列整齐，构成基粒的垛叠层数较多（图3，B）；嗜锇颗粒及囊泡较少。突变体的绿色叶片组织内叶肉细胞和叶绿体的超微结构与正常植株相似。突变体浅绿叶片组织的部分叶绿体形状与正常植株相似，呈纺锤形，但多数叶绿体发育异常，为近椭圆形（图3，C），基粒数目较少且排列疏松，基粒片层的垛叠层数明显减少（图3，D）；嗜锇颗粒较多且相对集中（图3，E），囊泡丰富（图3，F），说明突变体叶绿体结构发育存在明显的缺陷。

表1 文心兰浅绿条纹突变体与正常植株叶片的光合色素含量及比值Table1 Content and partial ratio of photosynthetic pigments in leaves of light green stripe mutant and normal plant of Oncidium

2.4 文心兰突变体与正常植株叶绿素荧光参数的比较

Fo和Fm分别是PSⅡ反应中心处于完全开放和完全关闭时的荧光产量，Fv／Fm反映PSⅡ反应中心潜在的最大光化学效率，Fv′／Fm′反 映 开 放 的PSⅡ反应中心原初光能捕获效率。如表2所示，文心兰突变体的Fo比正常植株高39%，但未达到显著水平，而其Fm、Fv／Fm、Fv′／Fm′均显著低于正常植株，降低幅度分别为48.1%、40.0%和48.5%。同时，ΦPSⅡ反映PSⅡ反应中心部分关闭情况下的实际光能捕获效率，文心兰突变体的光能捕获效率显著低于正常植株，比正常植株显著降低了53.5%。qP反映PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学传递的份额，NPQ代表PSⅡ天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的部分，文心兰突变体的qP、NPQ与正常植株相比有所降低但差异不显著，分别为正常植株的90.4%和92.6%。可见，文心兰突变体的叶绿体结构可能受到破坏，导致捕光色素蛋白复合物减少，PSⅡ活性大大降低，PSⅡ的光能捕获率降低，不利于光能的利用，但其光化学淬灭和非光化学淬灭没有受到显著影响。

图2 文心兰浅绿条纹突变体（MT）与正常植株（WT）叶片的叶绿素合成前体物质相对含量Fig.2 Relative contents of precursors for biosynthesis of chlorophyll in leaves of light green stripe mutant（MT）and normal plant（WT）of Oncidium

图3 文心兰浅绿条纹突变体与正常植株的叶绿体超微结构Fig.3 The ultra－structure of chloroplast from light green stripe mutant and normal plant of Oncidium

表2 文心兰浅绿条纹突变体与正常植株叶片的叶绿素荧光动力学参数Table2 Chlorophyll fluorescence parameters in leaves of light green stripe mutant and normal plant of Oncidium

3 讨 论

叶色变异是一种常见的突变性状，突变植株叶片主要呈现白化、黄化、浅绿、白绿、黄绿、绿黄、条纹、斑点等表型［19］。本研究发现，文心兰条纹突变体中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量均显著低于正常植株，分别比正常植株降低37.1%、34.0%、30.8%和36.3%，引起叶色变异的直接原因是光合色素含量的减少。高等植物体内的叶绿素处于不断合成和降解的动态变化之中，其中任何一个环节受阻，都可能导致植物体叶绿素含量的变化，从而引起叶色变异。邵勤等［20］对甜瓜叶色黄化突变体叶绿素生物合成前体物质进行测定，结果表明受阻于PBG 与Urogen Ⅲ之间。吕明等［21］研究表明芥菜型油菜黄化突变体叶绿素合成代谢受阻于Coprogen Ⅲ至Proto Ⅸ的步骤。本研究中叶绿素合成前体物质含量的测定结果显示，突变体叶绿素合成途径受阻于Coprogen Ⅲ到Proto Ⅸ的过程，导致ALA、PBG、UrogenⅢ和CoprogenⅢ明显积累，而后续合成的Proto Ⅸ、Mg－proto Ⅸ和Pchlide含量则显著降低。综上所述，引起文心兰突变体叶色变异的主要是由于叶绿素生物合成受阻，导致叶绿素含量降低和比例发生改变，引起叶色变化。

据报道，大多叶色突变体叶绿体结构都发生了不同程度的改变［22－23］。曹莉等［24］对小麦黄化突变体叶绿体超微结构观察发现，金黄和绿黄突变体的叶绿体发育存在明显缺陷，金黄植株的叶绿体内无基粒、基质片层清晰可见，有淀粉粒，嗜锇颗粒较多，而绿黄植株的叶绿体内有基粒，但明显少于突变亲本，且基粒片层较少，基粒类囊体较发达。中华金叶榆子代黄叶苗叶绿体内膜系统发育缺陷，基粒片层垛叠失败，进而多种色素含量大幅下降，光合系统发育不完全，致使其叶片呈现黄色、光合性能下降、植株生长缓慢［25］。本研究的文心兰突变体叶绿体发育不完整，基粒数目及类囊体垛叠层数均减少，嗜锇颗粒较多，囊泡丰富，代谢能力弱。由此可以推断突变体叶色变异的原因可能是由于叶绿体发育受阻，使叶绿素失去了依托的物质基础，叶绿素合成陷于停滞状态，叶绿素含量降低，从而导致叶色改变。

叶绿素荧光参数是描述植物光合作用机理和光合生理状况的重要指标，光系统对光能的吸收、传递以及耗散等过程都可以通过叶绿素荧光参数的变化反映［26］，被广泛用于叶色突变体的光合机理研究。与正常植株相比，文心兰浅绿条纹突变体的Fo增加了39%，表明PSⅡ反应中心可能受到破坏，类囊体膜结构可能受到损伤［27－28］。高等植物Fv／Fm一般恒定在0.80～0.85［29－30］，当植物受到光抑制、环境胁迫或发生某些基因突变时，Fv／Fm值会出现显著变化。本研究中，突变体的Fv／Fm比正常植株减少了40%，然而突变体和正常植株均生长在相同的环境中，没有受到任何的环境胁迫，因此突变体Fv／Fm的显著降低不可能是外界环境引起的，推测可能是由于叶绿体结构受到破坏发生光抑制或者基因突变所致。Fv′／Fm′和ΦPSⅡ是对光适应状态下PSⅡ光化学过程的度量，本研究中文心兰突变体的Fv′／Fm′、ΦPSⅡ显著低于正常植株，可能是由于叶绿体结构受到破坏，导致捕光色素蛋白复合物减少，PSⅡ活性大大降低，PSⅡ的光能捕获率降低，不利于光能的利用；同时，突变体的qP、NPQ与正常植株无显著差异，表明突变体叶绿素在一定范围内降低时，对光化学淬灭和非光化学淬灭无显著影响。

综上所述，文心兰黄绿突变体叶绿素前体物质合成受阻和叶绿体结构发育不良，影响其叶绿素的正常合成，造成叶绿素含量降低，同时PSⅡ结构受到破坏，导致叶色改变，光能利用率下降。另外，植物叶色突变的机制较为复杂，是生理和遗传因素共同作用的结果，有关文心兰叶色变异的分子机制有待进一步深入研究。

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