两种人工接种方法鉴定RNA干涉介导的转基因玉米对矮花叶病的抗性

李燕萍, 李 磊, 张志勇, 沈小娟, 李晚忱, 付凤玲

(四川农业大学玉米研究所,成都 611130)

两种人工接种方法鉴定RNA干涉介导的转基因玉米对矮花叶病的抗性

李燕萍, 李 磊, 张志勇, 沈小娟, 李晚忱*, 付凤玲

(四川农业大学玉米研究所,成都 611130)

本研究采用两种人工接种方法,以玉米成株期病情指数为指标,鉴定了63个转基因玉米株系的田间抗病性。结果表明,T4代转化株系‘47’和‘13h2-3’的抗病性达R抗级,超过抗病对照‘H9-21’。有82.5%(52/63)的转基因株系抗病性比未转化对照显著提高,表明用反向重复的RNA干涉表达载体转化玉米,可获得转基因抗病毒材料,且干涉片段适度延长可增加获得抗病材料的几率。另外,本文通过两种病毒接种方法的比较,发现采用玻璃纤维刷苗床穿刺接种比常规石英砂摩擦接种具有更小的误差。

玉米; RNA干涉; 转基因; 矮花叶病毒; 抗病性

玉米矮花叶病发生范围广泛,危害程度严重,是玉米主产区的重要病害之一[1]。近年来,随着易感品种的大面积推广和耕地复种指数的提高,玉米矮花叶病已从何广达等[2]划分的有病区扩展到无病区,从零星发生发展为连片暴发。柴淑艳报道,自2009年以来,山西襄汾县夏播玉米田,累计发病面积达3.33万hm2,占夏播面积的50%,发病株率平均46.7%,最高达到90%以上,最低25%,受害田块减产50%～60%[3]。王攀等调查了陕西泾阳三渠镇2013年的春播玉米,发现矮花叶病病田率达91.7%,平均病株率70%以上田块占58%[4]。

研究表明,侵染我国玉米主产区的病毒毒源主要是甘蔗花叶病毒(SCMV)和玉米矮花叶病毒(MDMV)B株系[5-8],而研究表明,MDMV-B可划归于SCMV病毒类型,因此,引起我国玉米矮花叶病的毒源主要是SCMV[9-13]。

玉米矮花叶病主要通过媒介蚜虫传播,病害防治除及时控制蚜虫数量和加强田间管理外,培育抗病品种是防治病害的根本途径。随着植物转基因技术的快速发展和对RNA干涉原理的深入理解,利用转基因技术获得抗病材料进而培育抗病品种已成为可能[116]。

前期研究中,我们利用RNA干涉原理,针对SCMV病毒外壳蛋白(CP)基因和蛋白酶(P1)基因的保守序列,构建了不同长度片段具发夹结构的RNA干涉表达载体,利用农杆菌介导法和玉米芽尖法转化玉米自交系‘18-599红’的胚性愈伤和‘18-599白’的芽尖组织,经自交繁育和PCR检测,获得了63个遗传稳定的转基因玉米株系[1718]。本研究旨在对获得的转基因株系进行田间抗病性鉴定和评价,为转基因抗矮花叶病玉米品种培育提供抗性资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

前人研究表明,RNA干涉片段的长短影响其对病毒的干涉效率。因此前期研究中,笔者针对矮花叶病毒cp和p 1基因不同长度干涉片段构建了多个RNA干涉表达载体[17-18],分别用农杆菌介导法和玉米芽尖法转化自交系‘18-599红’和‘18-599白’,套袋自交结合PCR检测获得遗传稳定的T4～T5代转化株系。具体信息见表1。

表1 玉米转基因株系名录1)Table 1 Name of transgenic lines in maize

在抗病鉴定中,以自交系‘H9-21’为抗病对照,‘Mo17’为感病对照,‘18-599红’、‘18-599白’为非转基因对照。用于接种的病毒来自西北农林科技大学吴云锋教授实验室保存的玉米病叶,经感病自交系‘Mo17’复壮扩繁,取典型病叶-70℃保存备用。

1.2 田间试验设计

1.2.1 愈伤组织转化法得到的转基因T4代株系抗矮花叶病鉴定

T4代20个阳性株系种植在温江和雅安两地具有隔离墙的试验地,随机区组设计,2次重复,单行区,株行距为60 cm×80 cm,双株种植,每行14株,病毒采用石英砂摩擦法接种,具体见1.3。

1.2.2 愈伤组织转化法得到的转基因T5代株系抗矮花叶病鉴定

T5代22个阳性株系种植在雅安濆江农场和雅安农科所试验地,种植期与普通玉米间隔35 d,田间试验设计同1.2.1,病毒接种方法采用人工苗床结合玻璃纤维刷穿刺接种,具体接种方法见1.3。

1.2.3 芽尖转化法得到的转基因T4代株系抗矮花叶病鉴定

芽尖法获得的T4代21个阳性株系种植在雅安濆江农场和雅安农科所试验地,种植方法、试验设计及病毒接种方法同田间试验设计1.2.2。

以上田间试验均在抽雄期调查各供试材料的病情指数和抗病性,具体指标和标准见1.4。

1.3 两种病毒接种方法

玉米矮花叶病抗性鉴定,传统方法是采用金刚砂(或石英砂)摩擦接种法[19]。但在试验中发现这种接种方法因人为用力的不一致而造成较大的接种误差,因此本研究增加了人工苗床结合玻璃纤维刷穿刺法接种病毒,并对两种方法进行比较,试图提高接种效率并减少接种误差。

称取玉米矮花叶病典型病叶,用液氮研磨,然后用PBS缓冲液(NaCl 137 mmol/L,KCl 2.7 mmol/ L,Na2HPO410 mmol/L,KH2PO42 mmol/L)悬浮,质量体积比约为1%～2%,备用。

1)石英砂摩擦接种法：供试玉米材料生长至3～4叶期,将石英砂按玉米抗矮花叶病鉴定技术规范[19]加入到待接种病毒悬浮液中,用毛笔蘸取病毒悬浮液刷拭心叶下第一、第二叶基部,拇指和食指从叶基捋向叶尖,一周内重复接种2次,抽雄期进行抗病性鉴定。

2)人工苗床结合玻璃纤维刷穿刺接种法：将供试玉米材料播种于人工苗床,生长至3～4叶期,将病毒悬浮液用喷壶均匀喷雾于植株叶面,再用玻璃纤维刷(直径6μm)均匀地轻扎叶片若干次,在叶面造成微伤,最后再全面喷洒1次病毒悬浮液,一周后移栽大田,抽雄期调查其抗病性。

1.4 抗病性鉴定方法

根据中华人民共和国农业部发布的中华人民共和国农业行业标准《玉米抗病虫性鉴定技术规范第4部分：玉米抗矮花叶病鉴定技术规范》[19],在玉米进入抽雄期时记录症状级别,计算病情指数,并由此对田间成株期玉米进行抗性鉴定和评价。具体症状分级标准见表2,抗病级别依据病情指数按表3标准进行分级。病情指数计算按下式进行：

式中：DI为病情指数;N为病害某一级别的植株数; R为某级别的相应病级数值;M为病害的最高病级数值;T为调查总株数。

表2 玉米成株期矮花叶病症状级别划分Table 2 Symptom grading standard of maize dwarf mosaic disease at maize adult stage

表3 玉米矮花叶病的抗性评价标准Table 3 Resistance evaluation standard of maize dwarf mosaic disease

1.5 相关数据的统计分析

将2种病毒接种方法、3个转基因世代的病情指数,利用SPSS统计软件进行株系间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 两种病毒接种方法的比较

取自交系‘18-599红’4叶期同叶位新鲜叶3片,其中1片叶用喷壶喷洒PBS缓冲液,再用玻璃纤维刷轻扎叶片若干次(图1a),1片叶撒上少量石英砂,毛笔蘸取PBS缓冲液,在叶面上定向轻轻摩擦3次(图1b);第3片不做任何处理(图1c)。将处理好的3片叶置于倒置显微镜下观察,发现玻璃纤维刷穿刺法对叶片造成的伤口小,而且在叶面上呈均匀的散点状分布,有利于SCMV侵染活的宿主细胞,提高病毒侵染的成功率。而石英砂摩擦法对叶片造成的损伤面积大,呈连片状分布,而且不均匀,不利于病毒侵染,也会造成较大的接种误差。显微观察结果见图1。

选取愈伤组织转化得到的T4(采用石英砂摩擦法接种)和T5(采用玻璃纤维刷接穿刺接种)代株系在雅安濆江农场的病情指数数据,构建新的随机区组资料(表4),比较2种接种方法的优劣。

图1 倒置显微镜下观察两种接种方法对玉米叶片造成的损伤Fig.1 Microscopic observation of the injury to maize blades by two inoculation methods

表4 两种接种方法接种后玉米病情指数比较(雅安濆江农场)Table 4 The disease index comparison of two inoculation methods with SCMV

结果表明,石英砂接种法接种的植株病情指数平均值极差36.11、标准差11.85、变异系数15.93%;玻璃纤维刷法接种的植株病情指数平均值极差70.01、标准差17.93、变异系数33.95%。表明用石英砂法对各株系接种,病情指数变异小,不容易发现株系间的差异显著性;而玻璃纤维刷接种,病情指数变异大,易于发现各株系间的差异显著性。再从抗病对照自交系‘H9-21’两个区组的平均病情指数看,石英砂法为88.27,与感病对照自交系‘Mo17’的平均病情指数85.30几乎没有区别;而玻璃纤维刷法抗病与感病自交系病情指数差异明显,符合生产实际情况。

综上表明,玻璃纤维刷穿刺接种法采用直径6μm玻璃纤维穿刺玉米叶片,更能模拟蚜虫口针以刺吸方式传播SCMV的过程,加之对叶片损伤小而且损伤均匀分布,因此操作误差小,易于鉴别各株系的抗病性。

2.2 各株系抗病性比较

用SPSS软件的“一般线性模型”中“单变量”模块对各株系两地病情指数(愈伤组织T4株系因雅安数据失真,只用温江一地数据分析)进行随机区组资料的方差分析,再选择0.05显著水平下用Duncan法对供试株系的病情指数进行多重比较,结果见表5。属于抗性级别(R)的有从愈伤组织转化得到T4株系的‘47’和‘13h2-3’,外源基因分别为C404和P150,其抗性级别高于抗病对照‘H9-21’,三者的病情指数无显著差异;属于中抗级别(MR)的有转化愈伤组织获得的T4株系‘8(下)’等7个株系,其抗性级别与抗病对照‘H9-21’相同;转化愈伤组织获得的T5代‘68’、‘52B’2个株系,抗性级别低于‘H9-21’,其病情指数与‘H9-21’无显著差异;转化芽尖组织获得的T4代株系中的‘SL-13-4’等4个株系,抗性级别显著低于‘H9-21’。上述13个划归为中抗(MR)级别的株系中,来自外源基因C100的1个、P150的2个、C404的6个、P451的4个。上述分析表明,RNA干涉片段越长,抗性株系产生的机会越多。

与未转化自交系‘18-599红’、‘18-599白’及感病对照‘Mo17’(抗性级别为高感HS)相比,绝大部分转基因株系抗病性得到显著提高(52/63=82.5%),抗性为感病(S)以上级别。表明采用RNA干涉转基因技术可以明显提高玉米自交系对矮花叶病的抗病性。

表5 各株系病情指数及抗性评价1)Table 5 Disease index of transgenic lines and the resistance evaluation

3 讨论

3.1 一种新型玉米矮花叶病毒接种方法的可行性

1989年,林肯恕提出了经典的石英砂人工摩擦接种玉米矮花叶病毒的方法进行抗病性鉴定[20];并且在后来的几十年有关该病的抗性研究中,人工接种病毒一直采用此法;直到2006年,国家农业部以此法为基础,用技术规范的形式将其正式固定下来。在应用于农业研究的几十年中,该法在筛选优质的抗矮花叶病玉米种质资源和抗病玉米的常规杂交育种中发挥了不可替代的作用。但在笔者近年来对转基因材料的接种试验中,发现该法严重依赖接种者的操作经验和技巧,容易出现以下问题：

(1)易造成叶肉细胞损伤。众所周知,病毒只有侵染活的宿主细胞才能完成自身的一系列生物反应。而在田间实际操作的过程中,由于受人本身及工作量大小的影响,试验者在接种时往往会用力过猛,对叶片造成大面积机械损伤,叶片细胞大量坏死,使病毒无法正常侵染叶片细胞。

(2)操作误差偏大。在操作过程中,由于受田间工作量的影响,往往是由几个人同时接种病毒。不同的操作者摩擦力度必然不同,即使同一人操作,也难保证对每一植株接种力度均匀,因此引入的操作误差也不同、且误差较大。在转基因玉米的抗病性研究中,转基因玉米株系多,但每个株系的株数少,即使单株引入的操作误差都会极大地影响最终的分析结果。

(3)操作工作量较大。由于此方法必须在玉米苗种植或移栽至大田中方可进行,为了尽量减少抽样误差对结果分析的影响,必须由几个人同时在尽量短的时间内完成接种工作,比较耗费人力与物力。

本研究中应用人工苗床,结合玻璃纤维刷穿刺法接种玉米矮花叶病毒,通过显微镜下观察并与田间接种的试验数据比较,发现有如下优点：

(1)对叶片的损伤程度小。通常,玻璃纤维单丝的直径为几微米到二十几微米,相当于一根头发丝的1/20～1/5,一般肉眼可见的每束纤维原丝都由数百甚至上千根单丝组成。因此,在操作过程中能模拟蚜虫口针刺吸式传毒,达到对叶片最小程度的损伤,有利于伤口周围宿主细胞的存活,使病毒侵染的成功率大大提高,降低引入的操作误差。由于玻璃纤维丝具有较好的柔韧性,在操作过程中,手的力度不直接作用于叶片,而是通过玻璃纤维丝作用于叶片上,玻璃纤维丝的良好弯折度对手的力量起到了缓冲作用,且大量的玻璃纤维丝分散了手的力度,使得每根单丝最终作用于叶片上的力度均匀性好,这不仅减小了叶片的损伤程度,更重要的是对叶片造成的伤口也更为均匀一致,操作误差大大降低。

(2)降低了田间工作量。玻璃纤维穿刺接种法可在玉米苗移栽之前进行接种,此时还在苗床或育苗盘中的玉米苗相对集中,因此操作效率大大提高。通过本研究田间操作的效率对比,相同规模的试验,石英砂摩擦接种法需要4人,而用玻璃纤维穿刺接种法仅需1人。

3.2 RNAi介导转基因玉米的抗病性

本研究通过对RNAi片段介导的抗矮花叶病转基因玉米材料的抗性鉴定,获得了一批抗病性相对于非转基因对照自交系有不同程度提高的转基因玉米,但其中仅有2个株系表现为“抗病”,比抗病对照自交系‘H9-21’提高一个等级;63个株系中有13个表现“中抗”,抗病性与‘H9-21’相当或不及‘H9-21’;其余大部分转基因株系抗病性虽比未转化对照有小幅度提高,但仍鉴定为“感病”。因此,用转基因方法获得抗病材料,还需结合严格的田间抗病性筛选。在上述抗病性鉴定中,表现中抗的转基因材料株高基本正常,均能授粉结实,而感病材料特别是高感材料株高显著降低,叶片丛生,不能正常吐丝,因而难以结实。

从理论上讲,RNAi片段一旦整合到玉米基因组,应该对病毒靶基因造成降解使其不能复制,从而达到完全抗病的目的,但试验结果却远非如此简单,其原因还需进一步探讨。但试验结果表明,干涉片段越长,获得抗病材料的几率越高。

3.3 抗矮花叶病转基因受体的选择

玉米矮花叶病重发区主要在黄淮海主产区。近年来,在四川、云南也常有发生(作者在繁育田块经常见到矮花叶病株),尽管暂时没有造成严重损失,但其发展趋势应引起育种者关注。用转基因方法获得抗病材料可以加快抗病育种进程,而转基因研究常将愈伤组织作为受体。因此,能否高效诱导产生胚性愈伤组织的自交系就成为转基因受体选择的重要依据。‘18-599红’和‘18-599白’是西南玉米产区优良自交系,易感矮花叶病,且能诱导产生高质量的胚性愈伤组织,是外源基因遗传转化的优良受体。生产上一些易感品种,由于不能产生胚性愈伤组织而难以直接应用于转基因受体,但可通过回交转育改良其抗病性。

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(责任编辑：杨明丽)

Resistance evaluation of RNA interference-based transgenic maize to Maize dwarf mosaic virus by two artificial inoculation methods

Li Yanping, Li Lei, Zhang Zhiyong, Shen Xiaojuan, Li Wanchen, Fu Fengling

(Maize Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China)

Resistance of the 63 transformed lines was evaluated by disease index of maize at adult stage in field experiment by two artificial inoculation methods.The results showed that the resistant grade of the T4transformed lines‘47’and‘13h2-3’was R grade,higher than that of the resistant control‘H9-21’,and 82.5%(52/63)of the transformed lines had significantly higher resistance than non-transformed control lines.It is concluded that the transformation by reverse repeated RNA-interference expression vector is an effective method to obtain transformed materials for virus resistance.The resistance will be improved if the interference fragment has an appropriate length.In addition,it was found that puncturing inoculation by glass fiber brush in seedbed was of less deviation than conventional inoculation by quartz sand friction.

maize; RNA interference; transgene; Maize dwarf mosaic virus; resistance

S 432.21

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.028

2014-09-11

2014-11-03

转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08003-012B)

*通信作者 E-mail：aumdyms@sicau.edu.cn