枯草芽胞杆菌胞外抗菌蛋白的初步分离及性质的研究

黄 娜, 周莉质, 费 丹, 施扬玮, 徐 辉, 檀根甲

(安徽农业大学植物保护学院,合肥 230061)

枯草芽胞杆菌胞外抗菌蛋白的初步分离及性质的研究

黄 娜, 周莉质, 费 丹, 施扬玮, 徐 辉, 檀根甲*

(安徽农业大学植物保护学院,合肥 230061)

土壤中分离的枯草芽胞杆菌,其发酵液对苹果炭疽病菌具有很强的抑制作用。为了确定其抑菌物质的主要成分,本试验采用硫酸铵分级沉淀获得无菌滤液中的抗菌蛋白粗提物,超滤后经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,胶带回收进行分离鉴定,得到1种具有抑菌活性的蛋白条带。该蛋白对供试的6种植物病原真菌具有抑制作用,该蛋白的活性表现在80℃,30 min仍有抑菌作用,对p H(4～7)具有一定的适应范围、另外对紫外照射(0～12 h)、抑制剂、有机溶剂均不敏感。质谱鉴定该条带含有两种蛋白,分别为假定蛋白BSU35980 gi|16080651,相对分子量11 079 Da,等电点4.78,匹配率为68%;丝氨酸羟甲基转移酶gi|16080743,相对分子量为45 575 Da,等电点为5.56,匹配率为67%。显微观察发现抑菌蛋白可以使菌丝发生断裂、扭曲、畸形、肿大。

枯草芽胞杆菌; 凝胶电泳; 理化性质; 质谱鉴定

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是一种常见的植物内生菌,也是土壤和植物微生态的优势微生物种群,它具有很强的抗逆能力和抑菌作用[1],许多被分离的植株都已经成功地用于植物病害的生物防治[2]。如蒋跃明采用枯草芽胞杆菌培养液和多抗霉素处理荔枝果实,可以有效地防治荔枝霜霉侵染引起的贮藏病害,以两者混合处理效果最好[3];赵白鸽、孔建等用枯草芽胞杆菌B-903防治苹果轮纹病取得了很好的防效[4]。它的抑菌机理包括竞争作用、拮抗作用和诱导植物抗病性等。已报道的有抑菌作用的物质包括低分子量抑菌肽[5]、抑菌蛋白[6]和挥发性抑菌物质[7]等。

本试验从土壤中分离的枯草芽胞杆菌,使用硫酸铵分级沉淀法从该菌胞外代谢液中分离粗蛋白,并用聚丙烯胺凝胶电泳切胶回收初步纯化粗蛋白,得到一种抗菌蛋白条带,对该蛋白条带的抗真菌活性和部分理化性质进行了研究,并用质谱鉴定了该蛋白的结构,为以后的基因工程研究和生物农药研发奠定了理论基础。同时本试验也观察了抑菌蛋白对病原菌菌丝形态的影响,为以后的抑菌机理的深入研究提供支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

1.1.1 拮抗细菌

枯草芽胞杆菌(B.subtilis)从土壤中分离,由安徽农业大学植物保护学院植物病理实验室保存。

1.1.2 供试病原菌

苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum),由安徽农业大学植物保护学院植物病理实验室提供。

1.1.3 培养基的制备

细菌固体培养采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)(蛋白胨1%,牛肉膏1%,氯化钠0.5%,琼脂粉15～20 g,p H 7.2～7.4);液体培养采用牛肉膏蛋白胨液体培养基(NB);真菌用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉15～20 g)。

1.2 枯草芽胞杆菌发酵液抑菌物质的分离

1.2.1 枯草芽胞杆菌发酵液制备

从斜面培养基中挑取菌体接入NB液体培养基中,28℃、180 r/min振荡培养48 h,配制成细菌发酵液。4℃,8 000 r/min,离心30 min,去掉沉淀,用0.45μm滤膜过滤发酵上清液,得到无菌滤液,即为抑菌物质粗提物。

1.2.2 硫酸铵沉淀法提取粗蛋白

向无菌滤液中加入硫酸铵。4℃静置12 h,然后4℃,8 000 r/min,离心30 min。将沉淀溶于0.02 mol/L、p H 7.4的磷酸缓冲液中,即得到粗提蛋白。利用微量分光光度计测定蛋白的浓度。4℃保存备用。

1.3 枯草芽胞杆菌粗提蛋白的纯化

1.3.1 枯草芽胞杆菌粗提蛋白的超滤浓缩

将粗提蛋白缓慢加入截留分子量为3 k Da容积为5 m L的超滤离心管,5 000 r/min,4℃离心40 min后,向离心管中加入2 m L超纯水,重复上述步骤3～4次,当离心管中液体少于200μL时,顺着边缘插入枪头,轻轻吹打,混匀蛋白液,注意不要碰到超滤膜,然后吸取浓缩液,直到吸完。收集浓缩除杂的样品,用0.45μm的细菌过滤器对样品进行除菌处理,利用微量分光光度计测定蛋白的浓度。4℃保存备用。

1.3.2 枯草芽胞杆菌粗提蛋白的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

配制10%的分离胶10 m L,迅速沿着玻璃壁灌入玻璃板的缝隙至开口处,加上一层超纯水压平凝胶上端,静置30 min,灌注5%的层积胶至玻璃板顶端,插入梳子,室温下静置聚合30 min以上。待层积胶完全凝固后,拔出梳子,倒入非变性电泳缓冲液,取超滤得到的蛋白样品上样8个孔,每孔大约上样30μL。然后电泳,先用70 V恒压运行30 min,再100 V恒压运行2 h,停止电泳,整个操作过程保持恒温4℃,以防止蛋白质变性。剥胶后先用超纯水清洗,把凝胶两边的两个泳道的条带切去进行考马斯亮蓝R-250染色和快速脱色(40%甲醇和10%乙酸),剩余的凝胶置于4℃冰箱保存。

1.3.3 蛋白条带的切胶回收

将凝胶放置在白色底板上以增强颜色对比效果,使蛋白条带更易于辨认。将脱色后的胶条中目的蛋白质区间与未染色的凝胶中相应区间相互对应,推断出未染色凝胶中目的蛋白质的大致位置,用无菌刀片切下含蛋白质的胶条,逐一将胶条置于无菌研钵中充分研磨,收集研磨后的碎胶块置于50 m L离心管中,加入适量的非变性电泳缓冲液,混匀后将离心管置于4℃冰箱中。多次浸泡使回收率最大。然后将样品冷冻干燥浓缩,-20℃冰箱保存,使用前将其用无菌水配制成蛋白浓度为

0.02 mg/m L。

1.3.4 回收的胶条抑菌活性的检测

采用PDA平板对峙培养法检测分离的各个条带蛋白质的抑菌活性,配制苹果炭疽病菌分生孢子悬浮液1×105个/m L,均匀地涂在PDA平板上,用无菌打孔器在平板上均匀打孔,在孔中分别加入50μL样品,放在25℃培养箱中培养48 h,根据样品周围抑菌圈的大小确定样品对苹果炭疽病菌抑制作用,每个试验重复3次。

1.3.5 抑菌蛋白对苹果炭疽病菌菌丝形态的影响

根据PDA平板对峙培养法,选取抑菌圈最大的一个部分,用接种环挑取与炭疽病菌菌块交界处的菌丝于显微镜下观察,以正常的菌丝作对照。

1.3.6 抑菌蛋白对其他5种病原菌的抑制作用

采用PDA平板对峙培养法,在活化的病原真菌平板上用灭菌打孔器(直径为5 mm)制备菌饼,将菌饼接在PDA平板上,同时用无菌打孔器在菌饼周边等距离的位置打孔,在孔中加入50μL样品。在25℃培养箱中培养2～5 d,根据样品周围菌丝的生长情况与对照组的比较,确定对病原真菌菌丝生长的抑制作用。

1.4 抑菌蛋白的理化性质

1.4.1 温度对蛋白质抑菌活性的影响

将蛋白溶液分别在20、40、60、80、100、121℃处理30 min,分别以不做处理的蛋白溶液和无菌水作为对照,以苹果炭疽病菌为指示菌,采取平皿对峙法测定抑菌圈直径,每个处理重复3次。抑菌圈直径(mm)=对照的菌落直径-处理组的菌落直径;下同。

1.4.2 p H对蛋白质抑菌活性的影响

将蛋白溶液分别用0.1 mol/L的盐酸和氢氧化钠溶液调节p H为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,分别用不做处理的蛋白溶液和无菌水作为对照,以苹果炭疽病菌为指示菌,采取平皿对峙法测抑菌圈直径,每个处理重复3次。

1.4.3 紫外照射对蛋白抑菌活性的影响

将蛋白溶液分别用紫外照射0、2、4、6、8、10、12 h,分别用不做处理的蛋白溶液和无菌水作为对照,以苹果炭疽病菌为指示菌,采取平皿对峙法测抑菌圈直径,每个处理重复3次。

1.4.4 抑制剂对蛋白质抑菌活性的影响

将蛋白溶液分别用0.5 mg/mL EDTA、0.002 mg/ mL SDS、6 mg/mL DDT等体积混合,分别用加无菌水的蛋白溶液和无菌水作为对照,以苹果炭疽病菌为指示菌,采取平皿对峙法测抑菌圈直径,每个处理重复3次。

1.4.5 有机溶剂对蛋白质抑菌活性的影响

将蛋白溶液分别与丙酮、氯仿、甲醇、乙醚、乙酸乙酯等体积混合后,分别用加无菌水的蛋白溶液和无菌水作为对照,以苹果炭疽病菌为指示菌,采取平皿对峙法测抑菌圈直径,每个处理重复3次。

1.5 抑菌蛋白的质谱技术鉴定

将抑菌蛋白进行酶解,抽提酶解肽段,ESI质谱,然后用软件分析数据,对质谱鉴定的原始谱图数据进行标峰,得到带有质荷比和峰强度信息的peaklist文件,对质谱数据和理论谱进行质量上的匹配和打分,最后从鉴定的肽段中得到鉴定蛋白。

2 结果与分析

2.1 枯草芽胞杆菌发酵液中抑菌蛋白的分离及其对苹果炭疽菌的抑制作用

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条带(图1)显示,该粗提蛋白含有6种蛋白。抑菌结果(图2)表明,只有6号条带对苹果炭疽菌具有抑菌作用。

图1 粗蛋白的非变性聚丙烯胺凝胶电泳Fig.1 PAGE of crude proteins

图2 回收蛋白条带对苹果炭疽病菌的抑制作用Fig.2 Inhibition of Colletotrichum gloeosporioides by recovered proteins

显微观察苹果炭疽病菌菌丝经蛋白处理后,菌丝形态如图3所示,正常的菌丝形状比较规则,细长,而经蛋白处理后的菌丝发生断裂、扭曲、畸形、肿大。

图3 抗菌蛋白对苹果炭疽病菌菌丝形态的影响Fig.3 Effects of antifungal proteins on Colletotrichum gloeosporioides mycelia

2.2 抑菌蛋白对其他病原菌菌丝的抑制作用

试验结果(图4)表明,该抑菌蛋白对小麦赤霉病菌(F.graminearum)、小麦纹枯病菌(R.cerealis)、水稻纹枯病菌(R.solani)、棉花枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.vasinfectum)、油菜菌核病菌(S.sclerotiorum)的菌丝生长均有抑制作用。

图4 抑菌蛋白对5种病原菌菌丝的抑制作用Fig.4 The inhibition of five pathogenic fungus mycelia by antifungal proteins

表1 不同处理条件对蛋白质抑菌活性的影响1)Table 1 Influences of different conditions on the bacteriostatic activity of proteins

2.3 抑菌蛋白的理化性质

由表1可以看出,抑菌蛋白在20～60℃处理30 min的情况下,其活性没有明显的变化,80℃处理30 min虽然有所下降,但仍具有抑菌作用,说明该蛋白具有一定的耐热性;抑菌蛋白在p H 4～7抑菌活性保持稳定,当p H高于7时,抑菌活性有所下降;紫外照射和经抑制剂、有机溶剂处理对抑菌蛋白的抑菌活性均没有影响。上述结果表明,该抑菌蛋白具有较好的稳定性。

2.4 抑菌蛋白的质谱检测

对蛋白6号条带做质谱解析,结果(图5)所示,峰上标有数字(m/z值)的表示相应的峰有肽段匹配上;峰强度小于最大强度的5%时用粗体表示。数据库检测结果(表2)所示,表中的分值为鉴定结果得分,由Mascot数据分析软件检测NCBI数据库中细菌全库,通过计算得出分值在65分以上的结果可信(P＜0.05)。本结果有2种蛋白的分值超过65,分别为假定蛋白BSU35980、丝氨酸羟甲基转移酶,2种蛋白肽段的完整信息如表3所示,粗体标注的表示试验肽段与数据库蛋白理论肽段匹配的序列。

图5 蛋白质条带6的一级PMF谱图Fig.5 The PMF of No.6 protein

表2 质谱鉴定蛋白质条带6回收结果Table 2 The identification results of shot-gun for protein recovered from No.6 of Native-PAGE

3 结论与讨论

目前对于枯草芽胞杆菌抗菌物质的研究已有相关报道。如沈锦玉等[8]通过浓盐酸沉淀、乙醇抽提、离子交换层析和高效液相色谱法对枯草芽胞杆菌B115进行分离纯化,最终得到分子量为803.6 Da的抑菌物质。黄丽丽等[9]通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析、PAGE切胶电洗脱、阴离子交换层析从EIR-j发酵液中分离纯化得到分子量为51.9 k Da的抗菌蛋白j1。

本试验采取硫酸铵沉淀法、超滤浓缩、聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收以及抑菌试验得到抗菌蛋白,结果表明：该抗菌蛋白对供试的6种植物病原真菌具有抑制作用;该蛋白经80℃处理30 min仍有抑菌作用,对p H(4～7)具有一定的适应范围、对紫外照射(0～12 h)、抑制剂、有机溶剂均不敏感;显微观察发现它可以使菌丝发生断裂、扭曲、畸形、肿大;质谱鉴定,通过数据库比对该蛋白条带中含有Hypothetical protein BSU35980、Serine hydroxymethyltransferase两种蛋白。但是,是哪种蛋白具有抑菌作用,笔者正尝试对这两种蛋白进行单克隆表达,然后分别做抑菌试验进行分析。

表3 两种蛋白质点对应肽段的完整信息Table 3 Complete information of peptides of two proteins

[1] 檀根甲,李增智,刘淑芳,等.枯草芽孢杆菌BS80-6对苹果采后炭疽病的控病效果及作用机制[J].植物保护学报,2008, 35(3)：227-232.

[2] Tan Genjia,Fei Dan,Shi Yangwei,et al.Postharvest biological control of apple anthracnose by Bacillus subtilis BS80-6, A mutant strain through ion implantation[J].Plant Diseases and Pests,2014,5(3)：15-19.

[3] 蒋跃明,陈芳.生物菌防治荔枝采后病害的初步研究[J].果树科学,1997,14(3)：14-15.

[4] 赵白鸽,孔建,王文夕.枯草芽孢杆菌B-903对苹果轮纹病的抑制作用及其对病害的控制效果[J].植物病理学报,1997, 27(3)：213-214.

[5] Stein T.Bacillussubtilis antibiotics：structures,syntheses and specific functions[J].Molecular Microbiology,2005,56(4)：845-857.

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(责任编辑：田 喆)

Primary separation of an extracellular antifungal protein from Bacillus subtilis

Huang Na, Zhou Lizhi, Fei Dan, Shi Yangwei, Xu Hui, Tan Genjia

(College of Plant Protection,Anhui Agricultural University,Hefei 230061,China)

Bacillus subtilis was isolated from the soil,and the fermentation liquid had strong inhibitory action against Colletotrichum gloeosporioides.In order to identify the antimicrobial compounds,the antimicrobial substances were isolated and purified by(NH4)2SO4fractional precipitation,ultrafiltration,PAGE-polyacrylamide gel electrophoresis,and tape reciting.The results showed that the purified active protein had inhibitory action to 6 plant pathogenic fungi.The protein was found to be stable at 80℃for 30 min.The inhibitory activity of the protein was observed in the range of p H value from 4 to 7,and not sensitive to ultraviolet radiation,inhibitor and organic solvents.Two kinds of proteins contained in this stripe were identified by mass spectrum.They were the hypothetical protein BSU35980 gi|16080651,with a relative molecular mass of 11 079 Da and isoelectric point (p I)of 4.78,and a matching ratio of 68%,and serine hydroxymethyltransferase gi|16080743,with a relative molecular mass of 45 575 Da and isoelectric point(p I)of 5.56,and a matching ratio of 67%.Microscope observation revealed that the protein could break up and enlarge the mycelia.

Bacillus subtilis; PAGE-polyacrylamide gel electrophoresis; physiochemical property; mass spectrum identification

S 476.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.06.008

2014-11-09

201503-04

安徽省教育厅自然科学重点科研项目(KJ2007A095)

*通信作者 E-mail：tgj63@163.com