急性期川崎病患儿外周血单个核细胞NF-κB、MMP-9表达变化及意义

谈诚，韩勍，朱纯亮，李喆倩，刘丽莎

(南京医科大学附属南京儿童医院,南京 210008)

急性期川崎病患儿外周血单个核细胞NF-κB、MMP-9表达变化及意义

谈诚，韩勍，朱纯亮，李喆倩，刘丽莎

(南京医科大学附属南京儿童医院,南京 210008)

目的 探讨核细胞核因子-κB(NF-κB)和基质金属蛋白酶9 (MMP-9) 在川崎病发生、发展中的作用及其机制。方法 研究对象为川崎病患儿21例(川崎病组)、呼吸道感染患者18例(阳性对照组)、正常查体者17例(正常对照组)。采用密度梯度离心法无菌分离各组外周血PBMCs自然培养，采用RT-PCR法和Westen blot法测定细胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白，采用ELISA方法测定细胞上清液中MMP-9蛋白。将川崎病组外周血PBMCs体外培养并分为川崎病1、2、3组，川崎病1组继续自然培养，川崎病2组加入终浓度为20 nmol/L的NF-κB激动剂PMA，川崎病3组同时加入PMA(浓度同上)及终浓度为100 μmol/L的NF-κB抑制剂 PDTC，孵育2 h后收集上清液和细胞，分别采用RT-PCR法和Westen blot法测定NF-κB p65 mRNA和蛋白表达，采用ELISA法测定细胞上清液中MMP-9蛋白水平。结果 川崎病组PBMCs中NF-κB p65 mRNA、蛋白及上清液MMP-9表达均高于阳性对照组和健康对照组(P均<0.05)。川崎病1、3组PBMCs中NF-κB p65蛋白及上清液中MMP-9表达水平均低于川崎病2组(P均<0.05)。结论 急性期川崎病患儿外周血PBMCs 中NF-κB和细胞上清液中MMP-9表达增强；二者可能参与了川崎病的发生发展过程。。

川崎病；核因子-κB；基质金属蛋白酶9；外周血单个核细胞

川崎病又称皮肤黏膜淋巴结综合征(MCLS)，是一种好发于5岁以下儿童和婴幼儿的急性全身性血管炎性疾病，是小儿后天性心脏病的主要病因[1]。目前川崎病的发病机理尚不清楚。文献报道，多种因素参与其中，如单核巨噬细胞参与的免疫激活、一氧化氮参与的血管损伤、金属基质蛋白酶的作用以及血管内皮功能紊乱和损伤等[2]。2013年1～6月，我们观察了急性期川崎病患儿外周血单个核细胞(PBMCs) 中核因子κB(NF-κB)和细胞上清液中基质金属蛋白酶9 (MMP-9)的表达及NF-κB抑制剂对二者表达的调节作用，现分析结果，探讨NF-κB和MMP-9在川崎病发生发展中的作用及可能机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 研究对象为2013年1～6月收治的急性期川崎病患儿21例(川崎病组)，其中男13例、女8例，年龄3～6岁。均符合日本川崎病委员会修订的诊断标准(1984年修订第4版) ：①持续发热5 d以上，抗生素治疗无效；②四肢末端改变：初期手足硬性水肿，掌跖、指趾端发红，后期指趾端甲床皮肤移行处出现膜样蜕皮；③多形性皮疹；④双眼球结膜充血；⑤口唇及口腔改变：口唇潮红、杨梅舌、口腔及咽部弥漫潮红；⑥急性非化脓性颈部淋巴结肿大。患儿就诊前均未使用过免疫抑制剂或免疫调节剂, 并除外先天性或遗传性疾病。选取同期上呼吸道感染患儿18例为阳性对照组，其中男11例、女7例，年龄3～6岁；另选取健康体检正常儿童17例为健康对照组，其中男10例、女7例，年龄3～6岁。三组性别、年龄分布差异无统计学意义。本研究均取得患儿监护人书面知情同意。

1.2 PBMCs中NF-κB p65 mRNA、蛋白表达及细胞上清液MMP-9水平检测 无菌采集各组外周静脉血5 mL，采用密度梯度离心法分离PBMCs。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基调细胞浓度为106/mL，接种于24孔培养板内，每孔1 mL。采用RT-PCR法检测NF-κB p65 mRNA，具体方法为：采用Trizol一步法抽提PBMCs的总RNA。具体步骤参照试剂盒说明书。用核酸定量仪测定总RNA含量和纯度，分光光度计上测定A260/A280值为2.0～2.2。RNA行琼脂糖电泳鉴定RNA完整性后应用于逆转录试验。采用Westen blot法检测NF-κB p65蛋白表达：收集各组PBMCs，取70 mL蛋白裂解液RIPA进行裂解。收集裂解产物12 000 g/min离心10 min，取上清并分装，于-80 ℃保存。每组蛋白取20 g上样于10%的SDS-PAGE胶，电泳2 h。用湿转移的方法转印到0.22 mm孔径的PVDF膜上。室温下置于5%BSA中封闭1 h；加入特异性的一抗，4 ℃过夜；TBST液漂洗3次，每次15 min，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h。再用TBST漂洗3次，用ECL化学发光检测。用移液枪吸取培养细胞上清液，采用ELISA 双抗体夹心法检测MMP-9 水平。步骤严格按说明书操作。

1.3 NF-κB抑制剂对川崎病患儿PBMCs中NF-κB及细胞上清液MMP-9表达影响的观察 取川崎病组PBMCs接种于24孔板并分为川崎病1、2、3组。川崎病1组为空白对照组，常规培养；川崎病2组加入终浓度为20 nmol/L的NF-κB激动剂PMA；川崎病3组加入PMA(浓度同上)及终浓度为100 μmol/L的NF-κB抑制剂PDTC。培养2 h后采用1.2方法检测各组PBMCs中NF-κB p65表达和MMP-9水平。

2 结果

川崎病组PBMCs中NF-κB p65 mRNA、蛋白及上清液MMP-9表达均高于阳性对照组和健康对照组，P均<0.05。见表1。川崎病2组PBMCs中NF-κB p65蛋白及上清液中MMP-9表达水平均高于川崎病1组(P均<0.05)；川崎病1、3组PBMCs中NF-κB p65蛋白及上清液中MMP-9表达水平均低于2组(P均<0.05)。见表2。

表1 各组PBMCs中NF-κB p65 mRNA、蛋白表达及细胞上清液MMP-9水平比较

注：与阳性对照组相比，*P<0.05；与健康对照组相比，#P<0.05。

表2 川崎病1、2、3组PBMCs中NF-κB p65和上清液中MMP-9表达比较

注：与川崎病1组相比，*P<0.05；与川崎病2组相比，#P<0.05。

3 讨论

NF-κB是一种广泛存在的转录因子，可在多种细胞中被激活，通过调节多种前炎性因子/趋化因子、黏附分子、生长因子等的表达，在应激反应、炎症和免疫反应、细胞凋亡等过程中发挥重要的作用[3]。NF-κB是由两种Rel家族蛋白组成的能与DNA结合的二聚体蛋白质，p65/p50异源二聚体是其最主要的组合形式。在静息状态下，NF-κB与其抑制因子IκB结合在一起，以无活性的NF-κB/IκB形式存在于细胞质中，在氧化剂(PMA等)、炎症细胞因子等各种激动因素的作用下，IκB被磷酸化并水解，暴露出p50亚基的易位信号和p65亚基的DNA位点，从而使p50/p65异二聚体表现出NF-κB活性，NF-κB从细胞质中移入细胞核内，发挥基因转录的作用[4]。

MMPs是一组锌离子(Zn2+)依赖性的内源性蛋白水解酶家族，可降解大部分细胞外基质成分，并参与炎性反应、缺血缺氧损伤、心血管和癌症等的生理和病理过程[5]。MMP-9是MMPs 家族主要成员之一，来源于中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞及心肌细胞等，可降解明胶、Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原、Ⅵ型胶原、纤维连接蛋白和弹性蛋白，在细胞外基质的降解和组织重建中起非常重要的作用[6]。

研究证实，NF-κB活化可能通过调节炎性因子、黏附分子等的表达参与川崎病血管炎性损伤的病理过程[7]。Ichiyama等[8]报道，急性期川崎病患儿外周血CD4阳性单核巨噬细胞和CD3阳性T细胞中均有NF-κB表达，在给予大剂量的丙种球蛋白治疗后NF-κB表达明显减弱。表明NF-κB作为始发炎症反应的上游，活化后与相应靶基因结合，调控一系列炎性因子表达。 Gavin等[9]观察了川崎病急性期死亡患儿的冠状动脉瘤，发现受损冠状动脉的组织结构完整性被破坏，弹力纤维层片状断裂，同时伴有炎细胞大量增殖浸润，如中性粒细胞、血管平滑肌细胞等，MMP-9 在受损冠状动脉全层及浸润的炎细胞中高表达，而在无冠状动脉病变的对照组未观察到上述现象。另有研究表明急性期川崎病患儿血清中MMP-9表达上调[10]，其表达水平的动态变化对于冠状动脉病变的早期诊断具有重要意义。

本研究结果显示，川崎病患儿PBMCs在自然培养条件下有一定量NF-κB和MMP-9的表达，加入NF-κB激动剂PMA 后NF-κB表达和细胞培养上清液中MMP-9水平显著增加；而同时加入NF-κB特异性抑制剂PDTC和PMA后NF-κB活化被显著抑制，相应的MMP-9水平明显降低。鉴于MMP-9基因的启动子调控区有NF-κB 特异的结合位点[11]，笔者推测急性期川崎病的病理损伤可能由NF-κB的活化所介导，同时启动和调节MMP-9的转录，最终导致炎性病理损伤。NF-κB可能作为始发炎症反应的上游环节在介导川崎病血管免疫炎性损伤中起重要作用。

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Experimental study on the NF-κB-mediated matrix metalloproteinase-9 expression in peripheral blood mononuclear cells in patients with Kawasaki disease

TANCheng,HANQin,ZHUChun-liang,LIZhe-qian,LIULi-sha

(Children′sHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,China)

Objective To explore the activation of nuclear factor-kappaB (NF-κB) and matrix metalloproteases 9(MMP-9) in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)in children with Kawasaki disease and the relationship between NF-κB and MMP-9. Methods PBMCs were isolated and purified from blood of fifty-six children including 21children with KD, 18 children with general inflammatory and 17 normal ones by density gradient centrifugation，and were cultured for one hour after cell concentration adjusted to 106/mL. Then both KD group and Control group were divided into three groups，the first group was cultured naturally, the second one was stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA), and the third one was stimulated by PMA and pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC). PBMCs were cultured for 2 h. The mRNA and protein levels of NF-κB p65 in PBMCs in each groups were measured by RT-PCR and Western blot, and the protein levels of MMP-9 were measured by ELISA. Results The mRNA and protein levels of NF-κB p65 and MMP-9 in KD group were much higher than that in other groups; Stimulating PBMCs by PMA，the mRNA and protein levels of NF-κB p65 and MMP-9 were markedly increased in each group, and there was a significant difference in each group (P<0.05); Using PDTC can reduce the activation of NF-κB in PBMCs, and the protein levels of MMP-9 were significantly reduced by using PDTC in KD group. Conclusions The activity of NF-κB and MMP-9 in PBMCs in patients with acute KD is distinctly increased; The specific inhibitor of NF-κB can inhibit it's activation and the expression of MMP-9 obviously. It suggested that the NF-κB pathway can lead to the activation of MMP-9 in acute KD, and proper application of specific inhibitor of NF-κB may be a new choice for treating KD.

Kawasaki disease； nuclear factor-kappaB；matrix metalloproteases 9； peripheral blood mononuclear cells

谈诚(1989-)，男，本科，住院医师，研究方向为自身免疫病病理机制。E-mail:781769659@qq.com。

刘丽莎(1984-)，女，医学硕士，住院医师，研究方向为自身免疫病病理机制。E-mail:58065421@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.004

R392.7；R34

A

1002-266X(2015)06-0011-03

2014-08-11)