用大豆乳清废水生产单细胞蛋白

温子健, 钱 方, 妥彦峰, 姜淑娟, 牟光庆

用大豆乳清废水生产单细胞蛋白

温子健, 钱 方, 妥彦峰, 姜淑娟, 牟光庆

(大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034)

根据大豆乳清废水特性,直接发酵热带假丝酵母、产朊假丝酵母、白假丝酵母、皱褶假丝酵母、白地霉、蓝莓酵母、核酸酵母、酒精酵母等8种酵母菌,其中产朊假丝酵母的产量最大。对产朊假丝酵母利用大豆乳清废水培养条件进行优化,确定了装液量为20%、接种量5%、培养温度28℃、培养时间22 h为适宜条件,优化后其菌体干重产量达到3.26 g/L,粗蛋白量为36.1%(菌干重),单细胞蛋白产量达到1.18 g/L。乳清废水中COD和BOD5去除率分别达到67.6%和63.2%。

大豆乳清废水;单细胞蛋白;产朊假丝酵母

0 引 言

大豆分离蛋白多用传统“碱溶酸沉法”生产,而目前困扰企业的最大问题是其副产物——大豆乳清废水,直接排放会造成环境污染[1]。据统计,每生产1 t大豆分离蛋白需排放10 t高浓度大豆乳清废水[2-3]。大豆乳清废水含固形物约2%,富含乳清蛋白、大豆低聚糖、少量大豆异黄酮、皂甙等生物有机成分,其中COD和BOD均高于1万,是宝贵的生物资源。酵母菌营养物质丰富,蛋白含量较高(50%),具有适应能力强、生长速度快、菌体大、易收集、价格便宜等特性,是生产单细胞蛋白(SCP)的良好菌种[4]。目前,世界蛋白资源严重缺乏,单细胞蛋白已成为现代食品工业和饲料工业的主要蛋白来源。

利用废弃资源发酵生产单细胞蛋白,前人已有相关研究。王有乐[5]、雷晓燕[6]等用产朊假丝酵母发酵淀粉生产废液,发酵后SCP得量较大,且淀粉废液COD明显降低。徐抗震等[7]以苹果渣混合菌发酵生产SCP,确定了菌种最佳混合比。刘启富等[8]也用酵母菌处理工业废水,并对获得的SCP进行了氨基酸分析,得到较为理想的蛋白质。为了解决企业难题,回收可利用生物资源,本研究直接用大豆乳清废水培养酵母菌生产SCP,从而达到既获得优质蛋白饲料,产生良好经济效益,又能大幅度降低废水有机成分,减小环境污染等目的。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 发酵液原料

利用碱提酸沉法,模拟大豆分离蛋白生产过程,实验室制备大豆乳清废水[9]。

1.1.2 菌 种

热带假丝酵母(Candida tropicalis)2.587,产朊假丝酵母(Candida utilis)2.120,白地霉(Geotrichum candidum)2.498,白假丝酵母(Candida albicans)2.538,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2.109,皱褶假丝酵母(Candida rugosa)2.1378,蓝莓酵母和核酸酵母等均由大连工业大学实验室提供。

1.1.3 培养基

YEPD培养基[10]:酵母膏1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,自然p H,固体培养基添加2%琼脂, 121℃灭菌15 min。

1.2实验方法

1.2.1 菌悬液制备

菌种活化:保藏菌种接种传代,挑取单菌落接种于YEPD液体培养基,28℃培养24 h,再按2%重新接种后于28℃、150 r/min摇床培养至浑浊。

菌悬液:菌液经4 000 r/min离心15 min后收集菌体,用无菌生理盐水洗涤2次,稀释成OD600为0.3的菌悬液。

1.2.2 发酵培养

菌悬液按2%接种量接种到大豆乳清废水中,28℃、150 r/min培养10 h。

1.2.3 种子培养

将活化菌接种于YEPD液体培养基中,于28℃、150 r/min进行培养,绘制菌落生长曲线以确定种子培养时间。

1.2.4 产单细胞蛋白培养条件优化

将种子液接种于大豆乳清废水中,在不同接种量、装液量、培养温度、培养时间等条件下进行培养。

1.3检测方法

利用恒重法[11]测定菌体量。收集菌体,生理盐水洗3次后于105℃烘干至恒重。

利用分光光度法[12]测定培养液OD600,计算菌浓度。

利用Folin-酚法[13]测定单细胞蛋白含量。离心收集菌体,加等体积水制成菌悬液,热碱法破壁溶出蛋白后测定蛋白含量[14]。

利用凯氏定氮法[15]测定单细胞蛋白;利用重铬酸钾法[16]测定COD;利用稀释与接种法[17]测定BOD5。

2 结果与分析

2.1大豆乳清废水生产单细胞蛋白菌种的筛选

经检测,大豆乳清废水作为高浓度有机废水,其COD可高达40 000 mg/L以上,可生化系数(B/C=BOD5/COD)大于0.4(0.3为可生化降解下限),废水营养物质充足,微生物可充分生长利用。考虑到产朊假丝酵母蛋白质含量高,在不需任何生长因子、只需少量氮源的条件下,能利用废液大量生长,易于制备单细胞蛋白;白地霉营养价值高,繁殖速度快,能利用多种碳源,细胞形体大,易回收分离,可供食用及饲料用[18-19]。本研究在不添加其他营养成分的前提下,直接利用大豆乳清废水发酵8种酵母菌,各菌体产量以及单细胞蛋白含量结果见图1。

图1 不同菌种利用大豆乳清废水生产单细胞蛋白(P＜0.05)Fig.1 Different strains producing single cell protein with soybean whey waste water(P＜0.05)

如图1所示,产朊假丝酵母生长最好,菌体产量最高为3.18 g/L,自身蛋白含量达到30.24% (蛋白质量/菌干重),远远高于其他菌株,表明产朊假丝酵母能较好地利用大豆乳清废水中的营养物质进行生长繁殖。因此,选择产朊假丝酵母作为发酵乳清废水生产单细胞蛋白的优势菌。

2.2产朊假丝酵母的种子培养时间

由图2可知,用YEPD液体培养基培养产朊假丝酵母0～4 h时菌体生长缓慢,处于调整期; 5～10 h时为对数生长期,菌体浓度明显上升,菌体生长力旺盛;10～14 h菌体浓度无明显变化, 14 h时出现再生长现象,但生长缓慢。这是由于产朊假丝酵母为兼性厌氧菌,在相对好氧条件下碳源耗尽后,酵母就会重新利用所产生的乙醇氧化生成二氧化碳和水[20]。此后,菌体生长缓慢且在22 h后衰退。因此选择对数生长期的产朊假丝酵母作为种子,确定种子培养时间为8 h。

图2 产朊假丝酵母生长曲线Fig.2 The growth curve of Candida utilis

2.3不同接种量对产朊假丝酵母生产单细胞蛋白的影响

研究表明,随着菌体浓度的增加,单细胞蛋白的含量也逐渐增大,因此可通过检测菌体浓度来间接反映单细胞含量的多少。由图3可知,接种量从2%提升到5%时,菌体浓度增加,达到OD600为0.835;接种量超过5%时,菌体浓度变化不大,且无显著性差异。因此,适宜的接种量决定菌体初始活力,并使菌体快速进入对数生长期,缩短生产周期。故选择5%接种量作为最适接种量。

图3 接种量对产朊假丝酵母生产单细胞蛋白的影响(P＜0.05)Fig.3 Effect of inoculum concentration on production of single cell protein with Candida utilis(P＜0.05)

2.4不同装液量对产朊假丝酵母生产单细胞蛋白的影响

由图4可知,随着大豆乳清废水装液量的增加,菌体浓度下降。这是由于培养液越多,溶解氧量越少,因而相应通气量越小。由此可见,产朊假丝酵母为好氧菌。因此,为获得大量菌体应尽量减少装液量以获得更多的溶解氧。当装液量为20%时,菌体OD600达到0.952。考虑到产量,装液量不能过低,故选择20%为最适装液量。

图4 装液量对产朊假丝酵母生产单细胞蛋白的影响(P＜0.05)Fig.4 Effect of broth volume on production of single cell protein with Candida utilis(P＜0.05)

2.5不同培养温度对产朊假丝酵母生产单细胞蛋白的影响

由图5可知,在28和30℃培养温度下,产朊假丝酵母生长情况较好,菌体OD600分别达到1.008和1.007,均高于26和32℃的菌浓度,综合考虑能耗因素,确定28℃为产朊假丝酵母利用大豆乳清废水生产单细胞蛋白的最适培养温度。

图5 培养温度对产朊假丝酵母生产单细胞蛋白的影响(P＜0.05)Fig.5 Effect of temperature on production of single cell protein with Candida utilis(P＜0.05)

2.6不同培养时间对产朊假丝酵母生产单细胞蛋白的影响

由图6可知,利用大豆乳清废水发酵产朊假丝酵母,18 h后菌体OD持续增加,22 h时达到最大值1.005。到24 h时无明显变化,且22和24 h菌体浓度无显著性差异。为了缩短生产周期,选择22 h为产朊假丝酵母的最适培养时间。

图6 培养时间对产朊假丝酵母生产单细胞蛋白的影响(P＜0.05)Fig.6 Effect of fermentation time on production of single cell protein with Candida utilis(P＜0.05)

3 结 论

本研究直接用大豆乳清废水(不外加其他任何营养成分)作培养基,从热带假丝酵母、产朊假丝酵母、白假丝酵母、白地霉、蓝莓酵母、核酸酵母、酿酒酵母以及褶皱假丝酵母中,筛选出产单细胞蛋白的最优菌种,为产朊假丝酵母,并优化大豆乳清废水生产单细胞蛋白的条件,确定最优条件为:装液量20%、接种量5%、28℃培养22 h。在此条件下大豆乳清废水发酵菌体干重产量达3.26 g/L,粗蛋白达36.1%(菌干重),单细胞蛋白干重产量为1.18 g/L。

用产朊假丝酵母处理大豆乳清废水后,COD和BOD5分别降低67.6%和63.2%,说明产朊假丝酵母处理大豆乳清废水能力较强。若要更大限度地降低大豆乳清废水直接排放对环境造成的污染,建议采用流加连续发酵方式,以达到国家排放标准。由此可见,不仅大豆乳清废水,其他食品工业废水也可被资源化利用,作为微生物发酵的良好原料生产SCP等产品。

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Production of single-cell protein with soybean whey waste water

WEN Zijian, QIAN Fang, TUO Yanfeng, JIANG Shujuan, MU Guangqing
(School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

According to the characteristics of soybean whey waste water,Candida tropicalis,Candida utilis,Candida albicans,Candida rugosa,Geotrichum candidum,Blueberry yeast,nucleic acid yeast and Saccharomyces cerevisiae were selected for single-cell protein production,in which the yield of C.utilis was the highest.The culture condition in soybean whey wastewater for C.utilis was optimized.The results showed that the yeast yield,crud protein content and production of single cell protein could reach to 3.26 g/L,36.1%(dry weight)and 1.18 g/L respectively when the volume was 20%,inoculum was 5%,temperature was at 28℃,and culture time was 22 h.In those conditions, removal rate of COD and BOD5was up to 67.6%and 63.2%respectively.

soybean whey waste water;single-cell protein;Candida utilis

TS219

:A

文章编号:1674-1404(2015)05-0313-04

2015-04-08.

“十二五”国家科技支撑计划项目(2013BAD18B04);国家海洋食品工程技术研究中心资助项目(2012FU125X03);辽宁省科学技术计划项目(2013229027);辽宁省高等学校重大科技平台项目(2011191);辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目(LR2013024).

温子健(1991-),男,硕士研究生;通信作者:钱方(1966-),女,教授.