急性胰腺炎大鼠血清NGAL变化及意义①

张舒扬，艾迎春

(1.佳木斯大学研究生学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院消化内科，黑龙江 佳木斯 154003)

急性胰腺炎大鼠血清NGAL变化及意义①

张舒扬1，艾迎春2

(1.佳木斯大学研究生学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院消化内科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：研究在急性胰腺炎大鼠血清中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)表达的变化。方法：建立大鼠急性胰腺炎模型，造模后将大鼠随机分为对照组、轻症急性胰腺炎组、重症急性胰腺炎组。于模型建立成功后6h、12h、24h及36h手术的大鼠利用HE染色观察大鼠胰腺组织的病理变化，以及用ELISA方法检测大鼠血清中淀粉酶与NGAL表达的变化。结果：胰腺组织的病理学评分显示各时间点对照组评分明显低于轻症急性胰腺炎组(P<0.05)；且轻症急性胰腺炎组评分明显低于重症胰腺炎组(P< 0.05)。术后各时间点重症急性胰腺炎组和轻症急性胰腺炎组大鼠血清淀粉酶明显高于对照组(P<0.05)，术后各时间点大鼠重症急性胰腺炎组血清中NGAL水平高于轻症急性胰腺炎组(P<0.05)；并且轻症急性胰腺炎组高于对照组(P<0.05)。在轻症急性胰腺炎组和重症急性胰腺炎组6h后大鼠血清中NGAL表达与对照组相比明显升高(P<0.05)，在24h，重症急性胰腺炎组大鼠血清中NGAL表达大幅度升高，在36h，轻症急性胰腺炎组与重症急性胰腺炎组大鼠血清中的NGAL水平均下降,但仍高于对照组(P<0.05)。结论：急性胰腺炎模型大鼠血清中NGAL的表达明显升高，并且重症急性胰腺炎大鼠血清中NGAL的表达量高于轻症急性胰腺炎，NGAL于重症急性胰腺炎早期升高明显，急性胰腺炎可促进大鼠NGAL表达增加。

急性胰腺炎；中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白；大鼠

急性胰腺炎(acutepanereatitis,AP)的病理生理过程是由多种因素参与，十分复杂的过程,且目前为止尚未完全阐明。胰腺的腺泡损伤、被激活的单核巨噬细胞与具有活性胰酶的释放，促使中性粒细胞产生大量的炎性物质，这些大量的炎性物质能够引起微循环的障碍与胰腺血管通透性增高，使得胰腺发生炎症及坏死等[1]。对急性胰腺炎的早期诊断和对其严重程度的正确评估是抓住治疗时机、提出相应治疗方案的基础,对预防各种并发症和器官衰竭有十分重要的作用，也对预后的改善、生活质量的提高具有重要的意义。因此对急性胰腺炎的早期正确判断和发病机制的研究十分重要。本实验通过观察急性胰腺炎大鼠在不同时间点血清NGAL的变化，以探讨急性胰腺炎与血清NGAL的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂

雄性Wistar大鼠60只，清洁级，体重200～250g，由佳木斯大学动物中心提供，大鼠在适应性喂养的情况下1周后实验。牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)，NGALELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 动物分组及模型建立

1.2.1 急性胰腺炎动物模型建立：手术前禁食12h，饮水不控制。将选取的大鼠用配制好的10%水合氯醛溶液，以0.3mL/100g剂量腹腔注射，待动物麻醉效果满意后，仰卧固定，术区常规消毒，去腹部正中切口，切开皮肤及皮下筋膜,暴露腹腔，找到十二指肠及胰腺组织，在近肝门的胆总管用血管夹夹闭，用4号针头注射器将牛磺胆酸钠从十二指肠大乳头穿入胆胰管约5mm,为防止注射液流入肠管，手指可以小心按压十二指肠乳头部，之后再缓慢匀速注入，注入后可看见胰腺组织红肿。注射完毕后，抽出针头，慢慢将肠道恢复原先位置，约3min后取出血管夹。之后关腹。所有手术后大鼠背部皮下注射约4mL生理盐水(2mL/l00g体重，每8小时1次),对饮水、摄食不干预。

1.2.2 分组：60只大鼠被随机分成3 组。对照组：打开腹腔后在不给予牛磺胆酸钠的情况下仅翻动胰腺数次后关闭腹腔；轻症急性胰腺炎组：打开腹腔后，将准备好的1%的牛磺胆酸钠按体重剂量(0.1mL/100g)从十二指肠的大乳头匀速注入胰胆管，注入完毕后关闭腹腔；重症急性胰腺炎组：打开腹腔后，将准备好的5%的牛磺胆酸钠按体重剂量(0.1mL/100g)，以同样的方法及速度注入，然后关闭腹腔。

1.2.3 主要检测指标: 模型制作后各组随机分别于6、12、24及36h各处死5只大鼠,打开腹腔，抽取心脏血5mL,以3000r/min离心分离血清后,放入-70℃冰箱内保存,待测血清中的淀粉酶及NGAL,同时取出胰腺组织放入10%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片及HE染色，在光学显微镜下观察胰腺组织的受损情况。采用Schmidt[2]的评分方法进行病理学评分。采用全自动生化分析仪测定血清淀粉酶。按照ELISA检测试剂盒说明检测大鼠血清中NGAL。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 胰腺组织的病理学观察及评分

重症急性胰腺炎组的胰腺6h镜下可见间质水肿，炎性细胞浸润，12h可见大量炎性细胞浸润及出血,见散在分布的点灶状暗红色坏死；24h及36h均可见广泛的坏死，有较为明显的炎性细胞弥漫浸润，广泛出血，存在核固缩、有空泡形成，伴有十分明显的皂化斑,且病变的严重程度随着手术后的时间延长而加重；轻症急性胰腺炎组改变相对较轻，可见间质水肿，炎性细胞浸润，有少量出血，小叶结构基本正常，未见组织坏死。对照组可见胰腺组织颜色均匀，结构完整，光泽度好，腺泡小叶清晰，间质未见渗出，未见皂化斑。在各时间点对照组大鼠胰腺组织评分明显低于轻症急性胰腺炎组，且有统计学意义(P<0.05)；各时间点轻症急性胰腺炎组大鼠评分水平明显低于重症急性胰腺炎组，存在统计学意义(P<0.05)。

表1 胰腺组织病理学评分的比较

*与重症急性胰腺炎组比较P<0.05，#与轻症急性胰腺炎比较P<0.05。

2.2 生化指标

在各时间点重症急性胰腺炎组和轻症急性胰腺炎组大鼠血清淀粉酶水平明显高于对照组，且有统计学意义(P<0.05)；但各时间点间重症急性胰腺炎组和轻症急性胰腺炎组大鼠血清淀粉酶水平无统计学意义(P>0.05)。在各时间点重症急性胰腺炎组大鼠血清中NGAL水平明显高于轻症急性胰腺炎组，且有统计学意义(P<0.05)；各时间点轻症急性胰腺炎组大鼠血清中NGAL水平明显高于对照组，存在统计学意义(P<0.05)。在轻症急性胰腺炎和重症急性胰腺炎大鼠6h后血清中NGAL表达与对照组相比明显升高(P<0.05)，在24h，重症急性胰腺炎大鼠血清中NGAL表达大幅度升高，36h轻症急性胰腺炎组与重症急性胰腺炎组的NGAL水平均下降,但仍高于对照组，有统计学意义(P<0.05)。见表2～3。

组别 6h 12h 24h 36h重症急性胰腺炎组6075．86±162．936783．53±220．597532．26±465．957666．35±790．08轻症急性胰腺炎组5855．98±232．796550．47±445．337042．61±498．646966．80±449．59对照组933．13±79．72∗#891．95±62．03∗#889．72±37．32∗#875．72±49．31

*与重症急性胰腺炎组比较P<0.05，#与轻症急性胰腺炎组比较P<0.05。

组别 6h 12h 24h 36h重症急性胰腺炎组442．40±22．98#1194．05±76．62#1663．81±81．98#1499．15±75．05#轻症急性胰腺炎组339．93±25．69∗874．87±37．61∗717．78±33．56∗422．59±46．91∗对照组77．84±5．96∗#77．96±6．38∗#78．31±6．46∗#84．70±8．85∗#

*与重症急性胰腺炎组比较P<0.05，#与轻症急性胰腺炎组比较P<0.05。

3 讨论

急性胰腺炎作为在临床中比较常见的急腹症，是指由于多种因素导致胰酶激活,其主要特征为胰腺的局部炎症反应，能够使得其他器官发生功能改变的疾病[3]。急性胰腺炎按严重程度可以被分为重症急性胰腺炎和轻症急性胰腺炎。轻症急性胰腺炎病情相对较轻，往往具有自限性,病程相对较短，预后较好。重症急性胰腺炎起病较急,病情相对严重,通常伴有一种或多种器官的衰竭,预后差,病死率较高[4]。

近些年以来该病的发病率呈上升趋势、患者年龄年轻化，这可能与人们在生活水平、饮食习惯和环境的改变有关，因此，寻找急性胰腺炎的较为早期诊断指标是对该疾病防治的核心问题之一。NGAL是由一条多肽链构成，含有178个氨基酸残基，分子量为25kD的小分子量分泌性蛋白，是lipocalin家族的成员，它最早在粒细胞内发现，同中性粒细胞明胶酶共价结合，大量的研究显示NGAL蛋白能够运输疏水性小分子，参与肿瘤细胞转移、炎症反应和细胞内铁离子转运等[5]。在一些炎症性疾病中,NGAL表达上调[6],并且被认为是一种急性期反应蛋白。NGAL在感染和炎症的情况下从激活中性粒细胞被释放，可以抑制急性感染。本研究通过对比对照组、轻症急性胰腺炎组及重症急性胰腺炎组大鼠血清中NGAL的表达，发现急性胰腺炎大鼠血清中NGAL水平表达上调，实验结果表明，轻症急性胰腺炎组24h血清淀粉酶水平及病理评分最高，36h有所下降，考虑轻症急性胰腺炎为自限性的疾病，且轻症急性胰腺炎大鼠血清中NGAL的表达规律与其病理评分呈正相关，提示说明NGAL在轻症急性胰腺炎大鼠早期起了一定的作用。重症急性胰腺炎大鼠术后血清淀粉酶与病理学评分逐渐升高，而NGAL水平在24h达到最高，36h有所下降，说明NGAL在重症急性胰腺炎大鼠早期起到了一定的作用，且NGAL的水平在重症组明显高于轻症组。本实验研究表明，重症急性胰腺炎大鼠较对照组早期即有NGAL表达升高，且随着病情加重逐渐升高，并于36h下降，轻症急性胰腺炎组大鼠较对照组早期NGAL表达也有所升高，但较重症组升高较低。在临床实践研究中，NGAL在胰腺炎和胰腺癌患者的血清中较健康对照组患者的血清中的水平显著升高[7]，这与我们的研究相一致。因此可以判断NGAL在重症急性胰腺炎大鼠早期升高明显，从而为重症急性胰腺炎的早期判断提供可能的血清学指标。

综上所述，血清NGAL作为一种急性反应蛋白，能准确反映出急性胰腺炎早期的严重程度。因此，检测血清NGAL将为急性胰腺炎的早期胰腺功能受损的诊断和临床胰腺功能受损情况的评估提供了更敏感、可靠的指标，有利于急性胰腺炎的早期判断和早期干预治疗。但NGAL的水平是否可以作为急性胰腺炎的早期诊断标准还有待进一步研究。

[1]田桦,邵艳艳,卓越.急性胰腺炎患者血清IL-1β和TNF-α的水平变化的研究[J].黑龙江医药科学,2008,31(3):72

[2]SchmidtJ,RattnerDW,LewandrowskiK,etal.Abettermodelofacutepancreatitisforevaluatingtherapy[J] .Annalsofsurgery, 1992 ,215(1) : 44 -56

[3]韩海军,朱利飞.急性胰腺炎63例血浆炎性因子的变化特点及临床意义[J].陕西医学杂志, 2014,43(9):1235-1237

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[5]刘静，李绍梅，薛雯，等. 原发性肾病综合征并发急性肾损伤患者血清与肾组织中NGAL的表达及意义[J]. 中国病理生理杂志, 2012,28(11):1982-1985

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The significance and changes of NGAL level in the serum of rats with acute pancreatitis

ZHANGShu-yang1,AIYing-chun2

(1.The Graduate School of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2. Department of Gastroenterology , the First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China)

Objective: To study the Changes in the expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in serum of rats with acute pancreatitis.Method: Rats were randomly divided into control group, mild acute pancreatitis group, severe acute pancreatitis group. After 6h、12h、24h and 36h of successful model establishment, the pathological changes in pancreatic tissue were examined in HE staining. The pancreatic amylase and the expression of NGAL were determined by ELISA.Results: At each time points, pathology scores of pancreatic tissue were significantly lower in control group than those in mild acute pancreatitis group(P<0.05).Scoresinmildacutepancreatitisgroupweresignificantlylowerthanthoseinseverepancreatitisgroup(P<0.05).Ateachtimepoint,serumamylaseenzymelevelsinallratsmodelwithsevereacutepancreatitisandmildacutepancreatitisgroupweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05).SerumNGALlevelsofratswithsevereacutepancreatitiswerehigherthanthoseinmildacutepancreatitisgroup(P<0.05).WhileserumNGALlevelsofratswithmildacutepancreatitiswerehigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05).TheexpressionsofNGALinserumofratinmildacutepancreatitisgroupandsevereacutepancreatitisgroupafter6hweresignificantlyincreasedcomparedwithcontrolgroup.TheexpressionofNGALintheserumofsevereacutepancreatitisgroupwasgreatlyincreasedinthe24h.TheNGALlevelofmildacutepancreatitisgroupandsevereacutepancreatitisgroupweredecreasedin36h,butstillhigherthanthatinthecontrolgroup(P<0.05).Conclusion: NGAL expression was significantly increased in serum of rats with acute pancreatitis. NGAL expression level was higher in severe acute pancreatitis than that in mild acute pancreatitis. NGAL increased obviously in the early stage of severe acute pancreatitis. Acute pancreatitis can promote the increase of the expression of NGAL in rats.

acute pancreatitis; neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL); rats

佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：LM2014_015。

张舒扬(1988～)女，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。

艾迎春(1960～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail:29250062@qq.com。

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A

1008-0104(2015)01-0061-03

2014-12-04)