去乙酰化胃肠激素联合G-CSF及bFGF促进糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的研究①

张立海，王 娇，陈福军，钟 敏，金 松，王桂梅，王亚洲，王跃生

(佳木斯大学附属第一医院普外一科，黑龙江 佳木斯 154003)

去乙酰化胃肠激素联合G-CSF及bFGF促进糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的研究①

张立海，王 娇，陈福军，钟 敏，金 松，王桂梅，王亚洲，王跃生

(佳木斯大学附属第一医院普外一科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：研究去乙酰化胃肠激素(UAG)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)联合碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的促进作用及作用机制。方法：以120例Wistar大鼠为研究对象，随机将其划分为A、B、C三组，并将每组40例进一步划分出组1、组2，各组1均为正常后肢缺血模型、组2均为糖尿病后肢缺血模型。A1、A2组不予药物干预；B1、B2组予G-CSF联合bFGF干预；C1、C2组予UAG、G-CSF联合bFGF干预。术后1周，每组取10只大鼠，检测缺血区组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达；术后4周，余大鼠行激光多普勒检测后肢肌肉血流后，处死并检测缺血区组织毛细血管数量。结果：MMP-9及VEGF表达均呈现C组>B组>A组、各组1>各组2趋势，且C组与A组、B组与A组间差异有统计学意义，同时C2组MMP-9及VEGF表达均明显高于B2组(P<0.05)；组内对比，A1、B1组分别明显高于A2、B2组(P<0.05)。肌肉血流及毛细血管数量亦呈现C组>B组>A组、各组1>各组2趋势，且C1组与A1组，B1组与A1组，C2、B2、A2间差异均有统计学意义(P<0.05)；组内对比A1、B1组分别明显高于A2、B2组(P<0.05)。结论：UAG联合G-CSF与bFGF可有效促进糖尿病大鼠缺血后肢血管新生，其机制可能与促进MMP-9、VEGF的表达有关。

糖尿病；肢体缺血；血管新生；基质金属蛋白酶-9；血管内皮生长因子

WHO预测，2025年世界范围内糖尿病患者可能达到3亿，将严重影响居民生活质量[1]。糖尿病所致各种并发症为其主要威胁，其中又以下肢缺血性病变较为常见，可进一步致死致残，较具威胁。现阶段对其的研究重点集中于促进血管新生，恢复下肢血流灌注，但糖尿病患者糖脂代谢紊乱、血管内皮细胞功能受损，常规促血管新生药物可能难以发挥作用[2]。G-CSF能够刺激内皮祖细胞的生长与分化[3]；局部应用bFGF则有助于改善局部细胞生长环境，促进内皮祖细胞向缺血组织趋化[4]；UAG有助于修复糖尿病患者EPC的活化缺陷。上述药物联用可能有助于缺血部位的血管新生，但尚需实验探究，故我们开展本动物学研究，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

雄性Wistar大鼠120只，均购自华中科技大学同济医学院动物实验中心，年龄10～12个月，体重250～280g；链脲菌素(上海岩生)、水合氯醛(上海岩生)、UAG(美国BioLegend)、bFGF(美国Sigma)、G-CSF(美国Sigma)、MMP-9酶联免疫试剂盒(武汉博士德)、VEGF酶联免疫试剂盒(上海森林雄科)、CD34酶联免疫试剂盒(武汉博士德)等；石蜡切片机(武汉博士德)、激光多普勒超声仪(瑞典百灵威)、酶标仪(美国BioTek)等。

1.2 方法

1.2.1 分组方法：所有大鼠按体重编号，行随机数字表法多层分组。首先分为A、B、C三组，每组40只；随后各组划分出组1、组2，各20例。共得A1、A2、B1、B2、C1、C2六组。

1.2.2 造模方法：各组1均制备糖尿病模型：禁食12h，腹腔注射链脲菌素(60mg/kg，溶于我院自制柠檬酸缓冲液)。一周后采集尾静脉血，空腹血糖超过300mg/dL说明造模成功。所有大鼠均制备后肢缺血模型：术前禁食12h、常规进水，戊巴比妥腹腔麻醉，仰卧固定于恒温操作台；右侧腹股沟做切口，至膝关节，分离肌层；随后暴露并分离股动脉，结扎、电灼，切除下段及分支。

1.2.3 用药方法：待模型建立完毕后，间隔6h开始给药，药物剂量：UAG隔日1次，每次腹腔注射30μmol/kg；G-CSF首7日每日一次，皮下注射10μg/kg；bFGF首7日隔日1次，共4次，缺血区肌注5μg/kg。A组予等量生理盐水，参考上述剂量注射；B组予G-CSF联合bFGF，按照上述计量注射；C组在B组基础上联合应用UAG。

1.2.4 观察项目：常规观察大鼠体重、毛色、大小便、后肢运动情况等；模型建立1周后，各组取10只大鼠，处死，取缺血区肌肉组织2g，分两份，分别用于检测MMP-9及VEGF，均采取ELISA检测法，操作步骤严格参照试剂说明书；模型建立4周后，行多普勒超声检测余大鼠下肢血流，随后处死，取缺血区组织，固定、包埋、切片后行ELISA法检测CD34阳性血管数，以评价大鼠微血管数量。

1.3 统计学方法

P<0.05为差异具备统计学意义。

2 结果

2.1MMP-9及VEGF表达对比

两者表达一般趋势均为：C组>B组>A组，且各组1>各组2。A、B、C三组间MMP-9水平行q检验指出B1、C1组均明显高于A1组(q=4.31，4.33；P<0.05)，B2、C2均明显高于A2组(q=3.82，4.58；P<0.05)，C2明显高于B2(q=4.28；P<0.05)；A、B、C三组组内对比，A1、B1分别明显高于A2、B2组。其他项对比，未见明显差异。VEGF表达统计学检验结果相同。见表1。

表1 大鼠MMP-9及VEGF表达对比

2.2 肌肉血流及微血管密度对比

两指标一般趋势亦为：C组>B组>A组，且各组1>各组2。A、B、C三组间肌肉血流PU值行q检验指出C1组、B1组均明显高于A1组(q=4.05，4.97；P<0.05)，B2、C2均明显高于A2组(q=3.47，3.99；P<0.05)，C2明显高于B2(q=4.05；P<0.05)；A、B、C三组组内对比，A1、B1均明显高于A2、B2组。其他项对比，未见明显差异。微血管密度统计学检验结果相同。见表2。

表2 肌肉血流及微血管密度对比±s)

3 讨论

有研究表明，骨髓间充质干细胞移植有助于促进糖尿病大鼠后肢缺血血管的新生，这可能是因为移植的干细胞中富含内皮祖细胞，其作为内皮细胞的前体细胞，能够迅速分化为血管内皮，进而使血管新生[5，6]。本研究借鉴该结论，但试图仅通过药物注射达到相似的效果，对照组应用的G-CSF，能够提升循环系统中内皮祖细胞数量，该药物为骨髓干细胞动员剂，早期研究证实其能够作用于中性粒细胞系，刺激粒细胞及单核巨噬细胞成熟并向外周血释放，近期亦有研究表明其能够促进内皮祖细胞增生，从而保证血管新生具有细胞基础[7]；在此基础上，对照组同时局部应用bFGF，其为促有丝分裂因子[8]，亦能诱导形态发生和分化，能够为内皮祖细胞的生长提供物质基础，进而促进内皮祖细胞向缺血区域趋化、归巢，能够提升靶向性，抑制其它组织的血管再生。本例中B组仅采用上述两药物联用，对糖尿病及非糖尿病后肢缺血模型均有一定作用，但B组组内对比，亦可表明，B1作用效果明显优于B2。这可能是由于糖尿病患者内皮祖细胞及早期循环内皮祖细胞动员受损所致。研究指出，内皮祖细胞的动员与血管内皮因子及MMP-9相关[9]，前者为血管内皮细胞有丝分裂原，与受体结合后，能够选择性地促进血管内皮祖细胞分裂增殖，为血管形成提供基质；后者则有助于膜结合型配体向松散型配体转化。本例A1、B1组中MMP-9及VEGF的表达均明显高于A2、B2组，能够直接证实糖尿病患者血管新生能力明显降低，术后4周观察肌肉血流及微血管数量，亦证实G-CSF联合bFGF的疗效尚需提升。

本研究结果同时能证实，在上述两类药物的基础上，联用UAG可能达到更佳的疗效，C2组大鼠MMP-9及VEGF水平均明显高于B2组，与之一致，其术后4周肌肉血流及微血管数量亦明显高于B2组。这可能说明UAG有助于修复糖尿病患者EPC活化的缺陷。既往有研究指出该药物能够抑制p53及p21的表达与堆积[10]，后两者均为调节细胞衰老的主要因子，大量堆积将导致内皮祖细胞老化、血管再生能力下降。经过输注UAG后，C1、C2组MMP-9及VEGF的表达量大体一致，能够说明大鼠内皮祖细胞的增殖与动员能力已恢复至无糖尿病水平[11]；但C1组与B1组MMP-9与VEGF的表达基本一致，则提示在正常人群中，UAG可能无法继续修复内皮祖细胞活化的缺陷，因此可以认为，对UAG仅适用于糖尿病相关下肢缺血症状的治疗，在其它下肢缺血症状中的疗效及作用机制尚需进一步探究[12]。总之，本研究说明G-CSF联合bFGF能够实现下肢缺血症状的血管再生，而对合并糖尿病患者，进一步联用UAG能够显著提升疗效。

[1]刘蔚,周翔海.用糖化血红蛋白诊断糖尿病——WHO咨询报告[J].中国糖尿病杂志,2011,19(1):2-10

[2]刘志国.糖尿病足溃疡诊治进展[J].中华损伤与修复杂志(电子版),2012,07(2):68-70

[3]JingYu,JunRen,Li-jundi,etal.MobilizationofPeripheralBloodStemCellsUsingRegimenCombiningDocetaxelwithGranulocyteColony-stimulatingFactorinBreastCancerPatients[J].ChineseJournalofCancerResearch, 2011, 23(1):49-53

[4]李海辉,蔡善君,宫鑫，等.蓝光对人视网膜色素上皮细胞α1D亚基蛋白表达及分泌VEGF和bFGF的影响[J].中华眼科杂志,2014,50(11):814-819

[5]张晓梅, 徐忠烨, 朱晓峰.bFGF、EGF联合应用对新生大鼠海马神经干细胞分化的影响[J].黑龙江医药科学, 2002,25(5):4-6

[6]盛宝英, 魏春杰, 杨晓玉,等.bFGF和BDNF对MCAO大鼠海马区神经干细胞原位增殖的影响[J]. 黑龙江医药科学，2010，33(3)：1-2

[7]金玉玲, 张晓梅, 朱晓峰.移植神经干细胞在脑缺血大鼠损伤脑区的定向分化及其对运动功能的影响[J].黑龙江医药科学,2005,28(1):1-3

[8]谢晓强,吕碧锋,章振保，等.G-CSF动员骨髓干细胞向缺血-再灌注肾脏归巢并促进肾脏修复的研究[J].中华急诊医学杂志,2012,21(5):491-496

[9]陈振波,赵俪梅,罗艳梅，等.共培养体系中卵巢癌细胞对内皮祖细胞成管及MMP-2和MMP-9表达的影响[J].第三军医大学学报,2013,35(10):956-960

[10]ElisaDied,LaviniaCasati,FrancescaPagani,etal.AcylatedandunacylatedghrelinprotectMC3T3-E1cellsagainsttert-butylhydroperoxide-inducedoxidativeinjury:pharmacologicalcharacterizationofghrelinreceptorandpossibleepigeneticinvolvement[J].Aminoacids, 2014, 46(7): 1715-1725

[11]金松，王翰锐. 碱性成纤维生长因子与血管内皮生长因子联合对大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生作用机制的研究[J].黑龙江医药科学，2013，36(3)：40-41

[12]金松，徐延森. 动脉硬化闭塞症血浆白介素-18、单核细胞趋化蛋白-1水平的观察急临床意义[J].黑龙江医药科学，2010，33(3)：24-25

黑龙江省教育厅科学技术研究项目，编号：12521551。

张立海(1979～)男，黑龙江桦南人，硕士，主治医师。

王跃生(1960～)男，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail：wys9906@163.com。

R

A

1008-0104(2015)02-0019-02

2015-01-06)