左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中GFAP及5-HT2A受体表达的影响①

聂 磊，王海燕，李春玉，邹艳红，王 禹，迟瑛娇，王 影,赵塔娜，赵冬梅

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中GFAP及5-HT2A受体表达的影响①

聂 磊，王海燕，李春玉，邹艳红，王 禹，迟瑛娇，王 影,赵塔娜，赵冬梅

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：通过建立氯化锂-匹罗卡品(Li-PILO)诱导的癫痫大鼠模型，观察左乙拉西坦(LEV)对癫痫大鼠海马组织中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及5-羟色胺2A(5-HT2A)受体动态表达的影响，进一步阐明左乙拉西坦的抗癫痫机制。方法：108只Wistar大鼠随机分为4组：生理盐水组(NS)24只、左乙拉西坦对照组(LEV)24只、模型组(Li-PILO)30只、模型组+左乙拉西坦组(Li-PILO+LEV)30只，分别给予LEV组和Li-PILO+LEV组大鼠LEV200mg/kg每日1次灌胃，连续28d。采用RT-PCR方法分别在第7天、第14天、第28天动态检测大鼠海马组织中GFAP和5-HT2A受体的表达。结果：(1)各组大鼠海马组织中GFAP表达水平：与NS组比较，Li-PILO组大鼠海马组织中GFAP在第7天、第14天、第28天表达水平显著升高(P<0.05)，且随时间延长升高更明显；与Li-PILO组比较，Li-PILO+LEV组GFAP表达水平明显降低(P<0.05)。(2)各组大鼠海马组织中5-HT2A受体表达水平：LEV对照组与NS组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与NS组比较Li-PILO组在第7天时表达水平降低，且随时间延长降低水平越明显，即在第14天、第28天5-HT2A受体表达水平明显降低(P<0.05)；与Li-PILO组比较，Li-PILO+LEV组5-HT2A受体在第7天、第14天、第28天表达水平明显升高(P<0.05)。结论：LVE的抗癫痫作用可能与通过上调5HT-2A受体的表达及抑制GFAP的表达有关，但具体作用机制还需进一步探讨。

左乙拉西坦；癫痫；胶质纤维酸性蛋白；5-羟色胺2A受体；氯化锂-匹罗卡品

癫痫是儿童时期常见的神经系统疾病之一，是脑部的一种慢性疾患，特点是大脑神经元反复发作性异常放电而引起相应的突发性和一过性脑功能障碍。反复、持续的癫痫发作会导致患儿的认知功能受影响，严重者还有脑水肿和颅内压增高的表现，甚至出现持久性神经精神障碍，从而影响患儿的生活质量[1,2]。然而许多抗癫痫药物会使患儿的认知功能受到不同程度的损害。因此需要寻求一种既有抗癫痫作用又有脑保护作用的抗癫痫药物，与其他抗癫痫药物抗癫痫机制不同，其他抗癫痫药物是通过增加脑中抑制性神经递质r-氨基丁酸(GABA)的含量而发挥抗癫痫作用。而左乙拉西坦抗癫痫机制独特，通过与中枢神经元突触囊泡蛋白结合而达到抗癫痫作用。突触囊泡蛋白主要分布在中枢神经系统内，具有调节突触前神经递质的释放和突触囊泡的外分泌的作用，突触囊泡蛋白基因破坏可导致严重的抽搐和过早死亡。左乙拉西坦(LVE)与突触囊泡蛋白有很高的结合能力，结合后可以与抑制神经元异常放电，从而发挥抗癫痫的作用[3]。研究发现LVE对于治疗多种癫痫发作类型有显著效果并有改善认知功能的作用[4]。本课题通过建立氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠模型，初步探讨LVE对癫痫大鼠海马组织中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和5-羟色胺2A(5-HT2A)受体表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组[5]

清洁级的Wistar大鼠108只(由大连医科大学动物实验中心提供)，体重约为80～100g，随机分为4组。即生理盐水组(NS)24只、左乙拉西坦组(LEV)24只、模型组(Li-PILO)30只、模型组+左乙拉西坦组(Li-PILO+LEV)30只。

1.2 实验试剂和癫痫模型建立

氯化锂和皮罗卡品(Sigma公司)，左乙拉西坦(UCBS.A.Belgim公司)，RT-PCR试剂盒和引物合成(北京华迈科生物技术有限公司)。动物模型的建立过程参照相关文献[7]并稍有改进，将Li-PILO组及Li-PILO+LEV组大鼠先腹腔注射氯化锂120mg/kg，20h后，再腹腔注射东莨菪碱1mg/kg，以拮抗外周胆碱能反应，30min后再次腹腔注射皮罗卡品80mg/kg，并观察大鼠的行为。大鼠的癫痫发作分级参照RACINE分级：0级—无反应或抽搐停止；Ⅰ级—面部抽动、咀嚼；Ⅱ级—面部抽动、咀嚼、点头；Ⅲ级—面部抽动、咀嚼、点头、前肢或后肢抽动；Ⅳ级—面部抽动、咀嚼、点头、前肢或后肢抽动、多肢抽动或强直；Ⅴ级—全面性强直阵挛发作。在大鼠癫痫发作30min后，立即腹腔注射地西泮(10mg/kg)终止癫痫发作。Li-PILO+LEV组在成功建立模型后的4h给予LVE200mg/kg，每日1次，连续28d，动态观察并分别于第7天、第14天、第28天提取海马组织进行实验。

1.3RT-PCR法检测大鼠海马组织中GFAP和5-HT2A受体的表达

模型建立28d后，4组大鼠给予10%水合氯醛(0.1mL/kg)麻醉后固定， 断头取出海马组织并立即放在液氮中保存。 海马组织匀浆后， 加入Trizol液提取mRNA，按照试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，

将cDNA产物进行Real-timePCR循环。从NCBI库中搜索到GFAP和5-HT2A受体应用Premier5.0引物设计软件设计引物。引物序列：GFAP上游：5’GGATGTGATGTGAGGTGTGC3’，下游：5’CCTCGG-GATCTTTTCCTTTC3’；5-HT2A上游：5’GGTTTCCTT-GTCATGCCTGT3’，下游：5’TGCAGGATTCTTTGCAGATG3’；内参GAPDH上游：5’TGCTTCACCACCTTCTTGA3’，下游：5’TCACCATCTTCCAGGAGCG3。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 观察大鼠行为学表现

NS组和LEV组无癫痫发作。匹罗卡品腹腔注射约5～10min后，Li-PILO组和Li-PILO+LEV组大鼠出现癫痫发作，表现为面部抽动、点头、洗脸、前肢阵挛、跌倒、以至全面性强直阵挛发作，其中Li-PILO组和Li-PILO+LEV组共有9只大鼠抽搐后死亡，癫痫发作30min后立即给予地西泮(10mg/kg)腹腔注射终止发作，在大鼠成功建立模型后，Li-PILO组和Li-PILO+LEV组大鼠表现出易激惹，并可观察到Ⅰ～Ⅳ级的癫痫发作。

2.2 各组大鼠海马组织中GFAP的表达

与NS组比较，Li-PILO组大鼠海马组织中GFAP在第7天、第14天、第28天表达水平显著升高(P<0.05)，且随时间延长GFAP表达水平升高更明显；与Li-PILO组比较，Li-PILO+LEV组GFAP表达水平明显降低(P<0.05)；LEV组与NS组比较无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

表1 海马组织中GFAP的相对表达量的比较

注：#与NS组比较，P<0.05；*与Li-PILO组比较，P<0.05。

A：Li-PILO+LEV组；B：Li-PILO组；C：NS组；D：LEV组

2.3 各组大鼠海马组织中5HT-2A受体的表达

NS组内各时间点5-HT2A受体表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与NS组比较，Li-PILO组在第7天时大鼠海马组织中5-HT2A受体表达水平降低，且随时间延长5-HT2A受体表达水

平明显降低，即在第14天、第28天5-HT2A受体表达水平明显降低(P<0.05)；与Li-PILO组比较，Li-PILO+LEV组5-HT2A受体在第7天、第14天、第28天表达水平明显升高(P<0.05)。见表2、图2。

A：Li-PILO+LEV组；B：Li-PILO组；C：NS组；D：LEV组

分组 第7天 第14天 第28天NS组GFAP0．662±0．1750．678±0．1640．698±0．188LEV组0．638±0．185△0．696±0．212△0．681±0．172△Li-PILO组0．473±0．235#0．338±0．242#0．215±0．086#Li-PILO+LEV组0．526±0．164∗0．412±0．139∗0．378+0．123∗F值 11．27 19．54 33．62P <0．05 <0．05 <0．05

注：#与NS组比较，P<0.05；*与Li-PILO组比较，P<0.05。

3 讨论

癫痫是小儿时期常见的神经系统疾病之一，其特点是自发、慢性、短暂、反复发作。癫痫可引起患儿的人格障碍、记忆力减退、智力低下等表现，尤其是在患儿的发育早期影响较大[7]。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种中间丝蛋白，主要存在于中枢神经系统星形细胞[8]。星形胶质细胞参与了神经递质的代谢，有研究证实星形胶质细胞能够释放谷氨酸，细胞外谷氨酸摄取80%～90%是通过星形胶质细胞谷氨酸转运。GFAP作为细胞骨架蛋白家族成员之一，在调节星形细胞运动及稳定神经突触形成过程中起到重要的作用。有研究报道，当神经系统受到损伤或刺激时，脑组织中GFAP表达上调[9]。兰莉等[10]通过用免疫组化方法研究发现，大鼠癫痫发作后GFAP星型胶质细胞增多。GarciaAD等[11]研究发现，癫痫发作后大鼠海马组织中GFAP表达明显升高。姜春玲等[12]报道，红藻氨酸(KA)癫痫大鼠海马结构内两种调控GFAP基因表达的结合蛋白在致痫后的第1天时表达升高，3周时升高更显著，至3个月时仍有较高表达。目前关于左乙拉西坦(LVE)对GFAP表达的影响，何绘敏等[13]研究报道，LVE可以抑制大鼠海马组织中GFAP表达升高。本实验研究结果显示，癫痫发作后海马组织中GFAP表达水平显著升高，且随着癫痫发作时间的延长，GFAP表达水平升高越显著，应用LVE治疗后GFAP的表达水平明显降低。由此可知，癫痫发作能够使GFAP星形胶质细胞增生，而LVE可以明显抑制其增生，从而达到抗癫痫作用。

5-羟色胺(5-HT)是一种吲哚衍生物，是重要的神经递质，其主要的作用有参与记忆和学习、情绪、食欲、体温调节、心血管功能、睡眠控制、性和致幻行为、调节内分泌和抑郁以及肌肉收缩等生理功能[14]。5-HT2A受体是5-HT受体的亚型之一。有研究报道5-HT2A受体与神经系统疾病密切相关，BergKA等[15]研究发现神经系统受损时脑组织中5-HT2A受体数目明显减少。然而目前关于5-HT2A受体与癫痫的关系国内外暂无报道，而关于5-HT与癫痫的关系报道很多，5-HT在含有抑制性递质γ氨基丁酸的神经元上表达，从而激活γ氨基丁酸，间接地发挥其抗癫痫作用。通过本课题研究我们发现，癫痫大鼠5-HT2A受体表达水平显著降低，尤其在第28天时降低更为显著，而治疗组5-HT2A受体表达水平明显升高，提示5-HT2A受体与癫痫有密切的关系，LVE的抗癫痫机制可能是通过升高5-HT2A的表达而发挥其抗癫痫作用。

综上所述，GFAP和5-HT2A受体与癫痫有密切的关系，都参与了癫痫的发生发展。LVE的抗癫痫作用可能与通过上调5HT-2A受体的表达及抑制GFAP的表达有关，但其具体作用机制还需进一步探讨。

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黑龙江省卫生厅科研课题，编号：2013-230。

聂磊(1977～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。

邹艳红(1978～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。E-mail：zyh19784120@163.com。

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1008-0104(2015)02-0026-03

2015-02-02)