夏枯草对草酸结石小鼠钙代谢及肾脏组织结构的影响

李 静，胡国全，桂敬强，贺绍君，刘德义，陈会良，靳二辉

（安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳233100）

夏枯草（Prunellavulgaris）属于唇形科夏枯草属植物，命名取其“夏至后即枯”之意，药用部位为干燥果穗，全草也可入药［1］，主要含有三萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、苯丙素、有机酸、挥发油及糖类等成分［2］。夏枯草在调节血压和血糖，消炎杀菌，抗病毒感染，抑制肿瘤生长方面广泛应用［3］。Utsunomiya M 等［4］首次发现在体外模拟试验中夏枯草水提取液能有效抑制草酸钙结晶的形成。夏枯草水提取液和甲醇提取物在体外对草酸钙结晶形成均有抑制作用［5］，推测其原因可能夏枯草促进草酸钙结晶的成核作用，但因其促进成核和微结晶作用，故而降低了草酸盐的饱和度，从而显著抑制草酸钙晶体的聚集和生长［6-7］。草酸钙结石属中医“石淋”、“砂淋”范畴［8］，病因是肾虚湿热蕴结于下焦、久之烧灼尿液中杂质结成砂石［9］，夏枯草苦寒，能除湿泻热，疏肝解郁。同时，夏枯草利尿作用明显，提示夏枯草可能成为防治结石的辅助药物［10］。本试验采用含10ml／L乙二醇和10g／L氯化铵溶液的饮水诱导形成草酸钙结石模型，测定小鼠血清、肝脏、肾脏、脑组织中钙的含量，探究夏枯草对草酸结石小鼠的钙代谢的影响，研究夏枯草对草酸结石小鼠肾小球和肾小管组织结构的保护作用，为进一步研究其药用价值和开发防治草酸结石的药物提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 由安徽省实验动物中心提供的SPF级昆明小鼠30只，雄性，60日龄，动物生产许可证号：SCXK（皖）2011-002。试验鼠颗粒饲料中钙含量1.43%，磷含量0.87%。小鼠饲养环境温度20℃～24℃，湿度50%～65%，光照12h～13h。

1.1.2 药品与试剂氯化铵（NH4Cl），批号：F20050621，分析纯，乙二醇（C2H6O2），批 号：T20110608，分析纯，均为国药集团化学试剂有限公司产品；夏枯草，安徽省福春堂中药饮片有限公司产品（经安徽科技学院食品药品学院时维静教授鉴定为正品），产地：湖南，批号2011063；生化分析试剂盒：钙试剂盒（批号142211014）、无机磷试剂盒（批号142411013），深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司产品；钙测定试剂盒（批号20120413）、磷测定试剂盒（批号20120418）、用于测定组织蛋白的考马斯亮蓝试剂盒（批号20120415），南京建成生物工程研究所产品；乙醇、二甲苯、伊红、苏木精等均为国产分析纯试剂。

1.1.3 主要仪器设备 自动煎药包装机，青岛达尔电子机械销售有限公司产品；Mindray BS-200全自动血清生化分析仪；分光光度计；离心机；高压蒸汽灭菌器；电动玻璃匀浆机；漩涡混合仪；LEICA-RM-2128型切片机，LY-1型展片机；Olympus-CH30显微摄影系统。

1.2 方法

1.2.1 草酸钙成石液的配制 参照文献［11］建立草酸钙结石模型小鼠方法配制草酸钙成石液：配制比例为：氯化铵1g，乙二醇1mL，用蒸馏水定容到100mL。

1.2.2 夏枯草水煎液的制备 将500g的夏枯草放入无纺布煎药袋中，浸泡入5L水中2h，自动煎药包装机煎煮至沸腾后文火30min，过滤；药渣再次加入2.5L水，煎煮至沸腾后文火20min，将两次滤液混合，浓缩至250mL，相当于2g／mL，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱存放。

1.2.3 分组与采样 小鼠适应性饲养1周后，按体重相近原则分为对照组、结石组和夏枯草组。结石组和夏枯草组饮用草酸钙成石液，对照组饮用蒸馏水。小鼠给药则采用灌胃方式，夏枯草组灌胃夏枯草水提取液10mL／kg，对照组和结石组灌胃相应体积的生理盐水，持续28d。试验结束时，小鼠禁食不禁水过夜，称重，双侧眼球摘除法采血，制备血清，血清中的钙、磷含量用Mindray BS-200全自动血清生化分析仪测定；处死剖检，取肝脏，肾脏，脑组织。按公式计算肾体比，肾体比率（%）＝肾脏湿重（g）／宰前活重（g）×100，其中左侧肾脏采用40g／L中性甲醛固定，石蜡包埋，6μm切片，HE染色，观察组织结构。肝脏，右侧肾脏，脑组织用冰生理盐水冲洗后制备100g／L的组织匀浆，用南京建成生物工程研究所生产试剂盒测定钙含量。

1.2.4 数据统计分析

2 结果

2.1 夏枯草对草酸钙结石小鼠体重和肾体比的影响结果见表1。

由表1数据可显示，各组小鼠的宰前体重差异均不显著，结石组的肾体比极显著高于对照组，均数高0.52%，结石组的肾体比极显著高于夏枯草组，均数高0.51%，而对照组和夏枯草组的肾体比差异不显著。

表1 各组小鼠肾脏指数的比较Table 1 The comparison of kidney index in each group of mice

2.2 夏枯草对草酸结石小鼠血清钙、磷及肝、肾、脑组织钙含量的影响

由表2数据显示，各组小鼠血清钙含量差异均不显著，结石组小鼠血清磷含量显著高于对照组和夏枯草组（P＜0.05），对照组和夏枯草组的血清磷含量差异不显著，结石组小鼠肾组织中钙含量显著高于对照组和夏枯草组（P＜0.05），对照组和夏枯草组的肾组织中钙含量差异不显著，各组肝组织、脑组织中的钙含量各组差异均不显著。

表2 各组小鼠血清钙、磷及肝、肾、脑组织钙含量的比较Table 2 The comparison of the calcium and phosphorus levels in sera and calcium in liver，kidney and brain in each group of mice

2.3 夏枯草对尿酸结石小鼠肾组织结构的影响

草酸钙结晶在常规HE病理切片下为无色透明晶体，由图1可见正常组小鼠肾小体断面接近圆形，毛细血管球位于肾小体中央且结构完好，肾小囊壁层和脏层细胞结构清晰，肾小囊的结构和体积大小正常，肾小管排列紧密，近端、远端肾小管组织结构清晰且管腔大小正常，近曲小管管径较粗，管腔较小，远曲小管管径较细，管腔较大，腔面规则，细胞排列紧密，对照组大鼠未见肾小管扩张和草酸钙晶体沉积，无病理变化；由图2可见肾脏髓质内远端肾小管和集合管管壁上皮细胞排列整齐，管腔大小正常，细胞界限明显。图3中结石组小鼠肾小球体积和囊腔大小正常，皮质部肾组织肿胀，近端肾小管的管壁肿胀变厚，管腔大小未见明显变化，远端肾小管管壁轻微变薄且管腔扩张，明显变大；图4中结石组部分髓质内远端肾小管和集合管管壁变薄且模糊，细胞数量减少，界线不清晰，细胞结构紊乱，上皮细胞坏死、脱落、变性，细胞核大部分降解，胞浆减少，排列不整齐，肾小管腔显著变粗大，异常扩张，管壁细胞结构不完整，变性、坏死，肾小管腔内有的大量弥漫散布的透明结晶体，部分结晶体形成较大的不规则四边形或六边形或连成片状，部分肾小管的管腔内可见嗜伊红样染色坏死物质，部分肾间质有明显慢性炎性细胞浸润。由图5可见夏枯草组肾小球的轻度萎缩，肾小囊腔变大，肾小囊壁层和脏层细胞结构模糊，近端肾小管的管壁肿胀轻度肿胀且管腔缩小，远端肾小管管壁变薄且管腔变大；图6显示夏枯草组肾髓质内远端肾小管和集合小管未见异常扩张，但部分肾小管管壁变薄，上皮细胞界限较为清晰，部分肾小管管腔中有红色丝状物质渗出，未见结晶体，髓袢细胞结构正常。

图1 对照组肾脏皮质（HE，400×）Fig.1 Kidney cortex in control group（HE，400×）

图2 对照组肾脏髓质（HE，400×）Fig.2 Kidney medulla in control group（HE，400×）

图3 结石组肾脏皮质（HE，400×）Fig.3 Kidney cortex in oxalate calcium stone group（HE，400×）

图4 结石组肾脏髓质（HE，400×）Fig.4 Kidney medulla in oxalate calcium stone group（HE，400×）

图5 夏枯草组肾脏皮质（HE，400×）Fig.5 Kidney cortex in Prunella vulgaris intervention group（HE，400×）

图6 夏枯草组肾脏髓质（HE，400×）Fig.6 Kidney medulla in Prunella vulgaris intervention group（HE，400×）

3 讨论

乙二醇是草酸的前体物质，在机体内可转化为草酸，从肾脏分泌排泄，氯化铵可酸化尿液，具有肾毒作用，可损害肾小管，二者协同，可形成泌尿系统的草酸钙结晶［12］。采用乙二醇配合不同药物或试剂作诱石剂诱发大鼠肾草酸钙结石模型，可以筛选、评价防治结石药物疗效［13］。本试验中结石组的肾体比极显著高于对照组和夏枯草组，可能草酸结石小鼠在氯化铵和乙二醇的刺激作用下，肾脏中草酸钙结晶沉积及继发的机械性、阻塞性炎症使肾脏肿胀增重。夏枯草组与对照组肾体比接近，说明夏枯草可能在减少肾脏中草酸钙结晶及缓解肾脏炎症方面发挥一定的作用。

机体内钙的代谢异常是引起含钙尿路结石的重要因素之一。泌尿系结石产生是由于体内促进结石和抑制结石的条件失衡所致，其成分以草酸钙结晶居多［14-15］，其形成与体内钙代谢和沉积及草酸代谢有关。草酸钙结石的形成与高钙尿有关，肾脏远曲小管和集合管的上皮细胞受损导致钙的重吸收障碍，也可导致肾小管上皮细胞的黏附性增加［16］。肖劲逐 等［17］研 究 表 明，饮 用 10mL／L 乙 二 醇 ＋30g／L NH4Cl 3.0mL 每天分2次灌胃 Wistar健康雄性大鼠，连续4次给予一定剂量的夏枯草不同提取物干预，结果显示各组钙磷无差异，夏枯草水溶和夏枯草500mL／L甲醇组肾钙明显低于草酸钙结石模型大鼠结石组。本研究的结果表明，各组血清钙差异不显著。结石组的肾组织钙浓度明显高于正常组和夏枯草组，差异有显著性意义，可能由于肾组织中形成大量草酸结晶有关。在夏枯草干预下，能够明显降低造模后雄性小鼠血钙和肾组织钙的浓度，结石组血磷升高，可能是机体为了保证血钙和血磷代谢的平衡，反馈地增强了肠道对磷吸收的结果。各组肝组织、脑组织的钙含量差异均不显著，说明尿道结石主要影响肾钙的含量，而不影响其他脏器组织中钙的含量影响。钙磷代谢受动物品系、试验条件等多种因素影响，夏枯草与钙代谢的关系需要进一步的验证和研究。

乙二醇和氯化铵是制备草酸钙结石模型常用药物，10g／L氯化铵和10mL／L乙二醇溶液给予小鼠自由饮用，可诱导形成草酸结石，本试验第28天，结石组的肾小管中可见大量的草酸结晶，肾小管扩张，与参考文献［18］报道一致。肾组织内的晶体沉积受到肝脏将乙二醇等草酸前体转变为草酸的速度以及尿钙和草酸的排泄等因素影响。从本试验可见夏枯草减少草酸结石小鼠肾组织中的结晶，并有效缓解肾小管和集合管的扩张，减少肾小管上皮细胞的损伤，提示夏枯草可能存在抑制尿草酸钙结晶形成物质，通过减少结晶保护肾脏，减少对肾小管的组织结构的损伤。肾脏受损与草酸钙晶体沉积相关，夏枯草可能通过吸附于草酸钙晶体表面的能力增强，抑制草酸钙结晶聚集和生长，以减缓肾小管细胞损伤。体外模拟环境与体内环境存在温度、pH等多种因素差异，体外试验证明，0.25mL夏枯草水提液对10 mL人工尿液中的一水草酸钙结晶的抑制指数随NaCl浓度和pH升高逐渐降低［19］。体外试验和体内试验，抗草酸结石作用机理和途径可能不同，虽然体外试验中夏枯草可显著抑制草酸结晶的形成，提示夏枯草中可能存在抑制尿草酸钙结晶形成物质，但其抗草酸结石的作用机制有待于进一步探讨。

夏枯草水煎煮液能够降低草酸结石小鼠肾组织中的钙含量，但对血清、肝、脑组织匀浆中钙含量均无显著差异，夏枯草能够减少肾小管内草酸钙结晶的大小和数量，减缓草酸结石小鼠肾小管的扩张程度，可保护肾脏的组织结构，在防治草酸钙结石中发挥一定的作用。

［1］刘 悦，宋少江，徐绥绪.夏枯草的化学成分及生物活性研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2003，20（1）：551.

［2］崔体圣，苗明三.夏枯草的化学、药理及临床应用探讨［J］.中医学报，2014，29（3）：386-388.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005：197-198.

［4］Utsunomiya M，Koide T，Yamaguchi S，et al.The effect of kampou medicine on the growth and aggregation of calcium oxalate crystalsinvitro［J］.Hinykika Kiyo，1991，37（10）：1097-1101.

［5］肖劲逐，李浩勇，梁培育，等.夏枯草提取物对尿草酸钙结石形成的抑制作用［J］.中华试验外科杂志，2007，24（12）：1605.

［6］Gohel M D，Wong S P.Chinese herbal medieines and their efficacy in treating renal stones［J］.Urol Res，2006，34：365-372.

［7］Koide T，Yamaguehi S，Utsunomiya M，et al.The inhibitory effect of kampou extracts oninvitrocalcium oxalate crystallization andinvivostone formation in an animal model［J］.Int J Urol，1995，2（2）：81-86.

［8］刘海华，张亚强.泌尿系结石中西医结合研究概述与展望［J］.北京中医药，2013，32（7）：553-555.

［9］刘玲珠.中医治疗泌尿结石近况［J］.右江民族医学院学报，1997（1）：152-153.

［10］肖劲逐.夏枯草提取物对尿草酸钙结石形成及肾结石大鼠osteopontin表达的影响［D］.湖南长沙：中南大学卫生部肝胆肠外科研究中心，2008.

［11］蒋一强，李 山，吴 闯，等.玉米须及芭蕉芯对小鼠肾草酸钙结晶抑制作用的形态定量研究［J］.成都中医药大学学报，1999，22（3）：37-38.

［12］钟 玲，苏泽轩.乙二醇法复制肾结石模型给药途径和方法的比较［J］.中国病理生理杂志，2000，16（4）：381-382.

［13］黄幼霞.乙二醇和氯化铵灌胃建立大鼠肾草酸钙结石模型的探讨［J］.海峡药学，2014，26（1）：48-49.

［14］An Z，Lee S，Oppenheimer H，et al.Attachment of calcium oxalate monohydrate crystals on patterned surfaces of proteins and lipid bilayers［J］.J Am Chem Soc，2010，132（38）：13188-13190.

［15］姚家喜，钱 彪，王勤章，等.蜀葵根预防和治疗大鼠肾草酸钙结石的效果评价及机制初探［J］.天津医药，2014，42（4）：329-332.

［16］Wahl C，Hess A.Kidney calculi-is nutrition a trigger or treatment［J］.Ther Umsch，2000，57（3）：138-145.

［17］肖劲逐，李浩勇，张国庆，等.夏枯草提取物对大鼠尿草酸钙结石形成的影响［J］.中国现代医学杂志，2008，18（11）：1486-1492.

［18］Divakar K，Pawar A T，Chandrasekhar S B，et al.Protective effect of the hydro-alcoholic extract ofRubiacordifoliaroots against ethylene glycol induced urolithiasis in rats［J］.Food Chem Toxicol，2010，48（4）：1013-1018.

［19］尹春萍，刘继红，张长弓.不同离子强度及pH值时泽泻和夏枯草对草酸钙结晶形成的抑制作用观察［J］.同济医科大学学报，1996，25（4）：321-322.