不同酶制剂对烤烟上部叶化学成分、游离态和糖苷结合态中性香气成分的影响

王 林, 朱金峰, 许自成*, 张景华

1.河南农业大学烟草学院, 郑州 450002;2.河南省烟草公司漯河市公司, 河南 漯河 462000

不同酶制剂对烤烟上部叶化学成分、游离态和糖苷结合态中性香气成分的影响

王 林1, 朱金峰2, 许自成1*, 张景华1

1.河南农业大学烟草学院, 郑州 450002;2.河南省烟草公司漯河市公司, 河南 漯河 462000

为研究酶制剂对烤烟上部叶品质提升的影响，以中烟100为材料，采用烘烤前叶面喷施酶制剂的方法，分析了不同酶制剂对烤烟上部叶化学成分、游离态和糖苷结合态中性香气成分的影响。结果表明：不同酶制剂能不同程度的降低烤烟的蛋白质含量，改善烟叶化学成分，提高游离态和糖苷结合态中性香气成分的含量；喷施酶制剂对烟叶蛋白质、总糖、还原糖、总氮均有显著的影响，而对烤烟钾、氯的影响则未达到显著水平；混和喷施酶制剂相对于单独喷施酶制剂对烟叶品质的影响更显著。

烤烟；酶制剂；蛋白质；化学成分；游离态；糖苷结合态

烟草是一种经济作物，烟叶的内在品质直接决定了烟叶的可用性及等级高低[1]。烟叶必须经过烘烤才能显现、固定并改善其在田间形成的品质质量，最终成为商品烟叶[2,3]。调制是烟草加工过程中提高其品质的一个重要环节，主要为烟叶内含物质的转化过程，其中酶起着关键性作用[4～7]。国内某些产区的上部叶品质较差，可用性低，造成烟叶的大量浪费。由于烟叶本身的内源酶和酶含量较少，单纯依靠烘烤过程中烟叶自身酶的作用不足以在短时间内把烟叶中不协调的成分充分转化，使品质得到改善，从而满足工业生产对于烟叶品质的需求[8,9]。因此适当的施加一些酶制剂可能会影响烟叶主要化学成分的含量，使烟叶内在成分比例更协调合理，从而改善烟叶在田间生长发育过程中由于一些营养缺失导致的品质降低，从本质上提高烟叶的等级并改善品质。目前，国内已展开了许多关于外加酶提高烟叶品质的研究，但研究多集中在利用外加酶在烟叶发酵过程中的作用来改善烟叶质量方面[10～13]，而在烟叶烘烤阶段利用外加酶的研究不多。本文研究了烘烤前喷施不同种类的酶制剂对上部叶化学成分、游离态和糖苷结合态中性香气成分的研究，探索了酶制剂在烟叶品质提高方面的优势，以及酶制剂通过烟叶内部代谢的影响，在烟叶调制过程中内含物质和色、香、味的充分转化方面的作用，分析比较了其变化规律和作用机制，以期为提高上部叶可用性提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2014年在河南省漯河市李集镇烟草科技示范园进行。实验用品种为中烟100。所用烟叶为上部叶(第16、18位置叶片)。酶制剂：中性蛋白酶(酶活力60 000 U/g)；α-淀粉酶(酶活力3 700 U/g)；糖化酶(酶活力10 000 U/g)。试验田土壤肥力中等，按当地施肥量合理施肥。

1.2 试验方法

将酶制剂按照表l的处理与适量蒸馏水混匀，烘烤前用喷雾器将酶制剂均匀地喷洒于上部叶正反面，对照处理以等量蒸馏水代替。烟叶处理后在阴暗处放置6 h，随后进行烘烤。

表1 酶处理条件

1.3 指标测试

1.3.1 烤后样品化学成分测定 可溶性蛋白采用考马斯亮兰法测定[14]；烟叶化学成分检测指标参照王瑞新等[15]的方法进行。

1.3.2 游离态和糖苷结合态香气物质的分析测定方法 游离态香气物质用GC/MC法测定烤后烟叶在二氯甲烷中的萃取物，再由国家烟草栽培生理生化研究基地进行测试[16]。糖苷结合态香气物质的测定包括糖苷类物质的分离和UPLC-MS/MS分析样品的制备，测定方法参考吴新华等[17]的方法进行。

1.4 仪器分析条件

1.4.1 GC-MS分析条件 色谱柱：PE-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国PE公司)；进样口温度：250℃；程序升温：50℃保持2 min，再以4℃/min的速率升至250℃；载气：氦气(He)；流速：1 mL/min；进样量：1 μL；分流比：30∶1。电子轰击(EI)离子源；电离能量：70 eV；离子源温度：170℃；传输线温度：250℃；溶剂延迟时间：4 min；扫描范围：35～350 m/z。

1.4.2 UPLC-MS/MS分析条件 色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速：1.0 mL/min，柱温为室温，检测波长：254 nm，进样量：5 μL，流动相A相：0.1%甲酸-甲酸铵水溶液;B相：甲醇;C相：乙腈，梯度洗脱程序如表2所示。

表2 梯度洗脱程序

质谱条件：ESI离子源，毛细管电压：3 500 V，干燥气温度350℃，干燥气流速10.0 L/min，雾化气压力50.0 psi。

2 结果与分析

2.1 不同酶制剂处理对烤烟上部叶蛋白质含量的影响

蛋白质是一类性质相对稳定的复杂高分子含氮化合物，优质烟叶的蛋白质含量应<10%，含量过高烟叶吸味差、刺激性强，影响烟叶的香味品质和安全性[18]。从表3均值分析，各处理相对于对照D1均有不同程度的提高，增幅表现为D5>D2>D3>D4。D2、D5处理对烤烟蛋白质的影响达到显著差异(P<0.05)，D3、D4的影响不显著(P>0.05)。说明酶制剂混合施用的效果最好，其次为中性蛋白酶，但单独喷施糖化酶和α-淀粉酶无不利影响。

表3 不同酶制剂处理对烤烟上部叶蛋白质含量的差异分析

注：表中数字为平均值±标准差，同行数据后的不同字母表示在P<0.05水平上差异显著。

2.2 不同酶制剂对烤烟上部叶化学成分的影响

如表4所示，相对于对照，D2、D3、D4、D5的烟碱、总糖、还原糖、总氮、钾含量均有提高，氯含量均有不同程度的减少。说明酶制剂可能在烟叶的烘烤过程中发挥作用，消耗或是转化存在于烟叶中的某些成分，使烟叶化学成分更协调。从方差分析结果(表4、表5)看出，D5对烤烟烟叶的烟碱、总糖、还原糖、总氮、氮碱比、钾氯比含量有显著的影响(P<0.05)，D2、D3、D4对烤烟烟叶的还原糖、总氮含量有显著影响，使烟叶化学成分更加协调；D3对烤烟烟叶总糖含量的影响显著，可能与酶制剂能够促进蛋白质和淀粉降解转化为可溶性糖有关。

表4 不同酶制剂处理对烤烟上部叶化学成分含量的差异分析

注：表中数字为平均值±标准差，同列数据后的不同字母表示P<0.05水平上差异显著。

表5 不同酶制剂处理对烤烟上部叶常规化学成分比值的差异分析

注：表中数字为平均值±标准差，同列数据后的不同字母表示P<0.05水平上差异显著。

2.3 不同酶制剂对烤烟上部叶游离态中性香气物质的影响

图1和图2表明，D2、D3、D4、D5的香味物质含量相对于对照D1的香味物质含量均有增加，且通过比较3种酶制剂对中性香气物质的增加量，发现混合喷施酶制剂的作用效果最好。烟叶的美拉德反应是指氨基酸和糖类发生的一类非酶棕色化反应，试验中D5的美拉德反应产物最高，其次为中性蛋白酶。新植二烯是烟草中性致香物质中重要的增香剂，不仅本身具有香甜气，又能氧化分解为呋喃等醇香味香气物质，直接影响烟草的香型风格[19]。D5的新植二烯总量最高，且α-淀粉酶含量明显优于其他3个处理。

图1 酶制剂对烤后烟叶苯丙氨酸类、美拉德反应产物和类西柏烷类含量的影响

2.4 不同处理对烤烟上部叶糖苷结合态中性香气物质的影响

通过采用UPLC-MS/MS分析法，定性定量分析了所测样品中的糖苷类香气前体物质的含量。对正负离子的多级质谱图进行分析，推测9种糖苷类前体物质其化学结构分别鉴定为紫罗兰醇-β-D-葡萄糖苷和其同分异构体、新绿原酸和其同分异构体、绿原酸和其同分异构体、隐绿原酸、芸香苷和山奈酚-3-芸香糖苷[20～23]。进而根据液相色谱图和质谱图的保留时间进行了相对含量的分析，发现不同酶制剂处理的糖苷类香气前体物质的总量表现为：D5最高，D2次之，说明D5处理对糖苷前体类物质的影响最大。糖苷类香气前体物质中芸香苷的含量明显高于其他物质，D5处理的芸香苷含量最高。D3的紫罗兰醇-β-D-葡萄糖苷和其同分异构体、隐绿原酸的含量较高，且与其他处理存在显著差异，说明α-淀粉酶对此类糖苷类物质影响较大。D2的新绿原酸和其同分异构体的含量较高，且新绿原酸的同分异构体与其他处理结果相比说明中性蛋白酶对此类糖苷类物质影响较大。D4的绿原酸和其同分异构体的含量较高，说明糖化酶对此类糖苷类物质影响较大。

图2 不同酶制剂对烤后烟叶类胡萝卜素降解产物、新植二烯含量的影响

表6 不同酶制剂处理对烤烟上部叶糖苷类香气前体物质含量的差异分析

注：表中数字为平均值±标准差，同行数据后的不同字母表示P<0.05水平上差异显著。

3 讨论

3.1 不同酶制剂对烤烟上部叶蛋白质含量的影响

烘烤过程是烟叶生理生化活动反应最为强烈的阶段，也是蛋白质降解的关键时期。酶制剂原理是当烟叶细胞膜破裂，外源酶进入细胞内，将存在于烟叶中的一些内源性大分子物质酶解转化成为小分子物质，改善卷烟抽吸品质，从而影响烟叶的使用价值。植株中的蛋白质通过内肽酶的作用水解为小肽，再被外肽酶分解为氨基酸[24,25]。宫长荣等[26,27]研究发现，蛋白酶的活性与蛋白质的降解和氨基酸的积累有着显著的关系。本试验中各处理对烟叶蛋白质均有影响，混合喷施酶制剂对烟叶蛋白质的效果最优，其次为中性蛋白酶，α-淀粉酶和糖化酶的影响不显著，但对蛋白质的降解无不利影响，且混合喷施时这两种酶对蛋白酶都有一定的促进作用。这与谢会雅等[28]研究得出的烟叶蛋白质经淀粉酶、糖化酶和蛋白酶处理后蛋白质有所降解的结论相一致。姚光明等[29]研究了不同种类蛋白酶酶解法对烟叶蛋白质的影响，发现中性蛋白酶的作用最显著。

3.2 不同酶制剂对烤烟上部叶化学成分的影响

研究发现烟叶本身所含有的酶能调节自身内含物质的转化，因此酶的催化能剧烈改变烟叶内部各种化学成分的含量[30～32]。李少鹏[33]在研究烟叶化学成分和酶的关系时分析得出，陈化过程中烟叶化学成分的动态变化规律与α-淀粉酶、蛋白酶活性的动态变化规律是一致的，所以酶的活动与烟叶化学成分密切相关。本试验结果初步显示，喷施酶处理的烤后烟叶化学成分含量较为协调，增加了烤后烟叶中烟碱、总糖、还原糖及钾含量，且效果显著。中性蛋白酶处理的烟叶的烟碱、总糖和还原糖含量有增加，α-淀粉酶、糖化酶处理的烟叶总糖、还原糖含量有所提高，但效果不显著，这与前人的研究结果一致。α-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶混合使用的效果相对单一酶制剂的使用效果更优，能显著地改善烟叶内在品质。

3.3 不同酶制剂对烤烟上部叶中性香气成分的影响

烟叶香气质量的优劣在一定程度上取决于挥发性香气物质总量的多少。本试验初步研究结果表明，相对于对照，混合喷施酶制剂的游离态中性香味物质含量均增加最多，其次为糖化酶。各类中性香气物质以美拉德反应的含量变化幅度最大，可能由于蛋白质在酶制剂的作用下降解生成氨基酸，使反应物增多，反应得以充分进行，产生更多的香气物质。糖苷类物质以其分子量大、沸点高，本身属于天然或者天然等同成分但不会干扰产品本身的香味，在陈化或燃烧过程中通过降解或裂解却能产生重要的致香类物质的特殊性质成为现今改善卷烟香气品质的热门方向[34]。糖苷类物质与水溶性糖、游离态香味物质、生物碱、色素等物质相似的性质，使得糖苷类物质的定性定量分析具有一定的难度。且研究发现，糖苷类物质受品种、生态条件、调制等多种因素的影响[35～39]。试验采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析法定性定量的鉴定了所选取烟叶中的9种糖苷类物质，并分析了不同酶制剂处理对烟叶中糖苷类物质含量的影响，发现混合喷施酶制剂对烟叶糖苷类物质的影响较大，特别是芸香苷含量的增幅比较大。

酶制剂的喷施对降低烟叶蛋白质含量、协调化学成分、提高烟叶游离态和糖苷结合态中性香气物质含量方面具有显著的作用，尤其以混合喷施酶制剂效果最好。而酶制剂均为酶类，本身也受温度和湿度等多种烘烤条件的影响，如何在烘烤过程中充分发挥酶制剂的潜力，借助其体内的物质代谢及分泌的胞外酶，实现烟叶在调制过程中内含物质和色、香、味的充分转化，将成为烟草行业研究的重点方向。

[1] 左天觉. 烟草的生产、生理和生物化学[M]. 上海:上海远东出版社,1993,48-62.

[2] 王传义，张忠锋，徐秀红，等. 烟叶烘烤特性研究进展[J]. 中国烟草科学,2009,30(1):38-41.

[3] 李富强，宋朝鸭，宫长荣，等．烤烟烘烤环境条件对烟叶品质影响研究进展[J]. 中国烟草学报,2007,13(4):70-74.

[4] 徐增汉，王能如，王书茂，等. 不同采收方式对烤烟上部叶烘烤质量的影响[J]. 安徽农业科学,2001,29 (5)：660-662.

[5] 董志坚，陈江华，宫长荣，等. 烟叶烘烤过程中不同变黄和定色温度下主要化学组成变化的研究[J]. 中国烟草科学,2000,3:21-24.

[6] 孙福山，王丽卿，刘 伟，等. 烟叶成熟度及烘烤关键指标与烟叶质量关系的研究[J]. 中国烟草科学,2002,3:25-27.

[7] 马 林．利用生物技术改变烟草化学组分提高其吸食品质和安全性的研究[J]. 郑州工程学院学报,200l,22(3):40-42.

[8] 宫长荣．烟草调制学[M]. 北京:中国农业出版社,2003.

[9] 程 彪，贾 涛，刘立全，等．烟草工业中酶和酶作用的控制与利用[J]. 烟草科技,1999,3:8-11.

[10] 朱大恒，陈 锐，陈再根，等．烤烟自然醇化与人工发酵过程中酶变化及其与酶活性关系的研究[J]. 中国烟草学报,2001,7(2):26-30.

[11] 牛燕丽，张 鹏，宋朝鹏，等．酶法降解河南烤烟烟叶B2F、C3F和X2L淀粉的初步试验[J]. 烟草科技,2005(3):26-28.

[12] 郑小嘎，刘 萍，张修国．烟叶人工发酵过程中增香途径的研究进展[J]. 山东农业大学学报:自然科学版,2003,34(1):144-147.

[13] 罗家基，朱子高，罗 毅，等．酶在烟叶发酵过程中的作用[J]. 烟草科技,1998,1:6.

[14] 张槐苓，葛翠英，毛多斌. 烟草分析与检验[M]. 郑州:河南科学技术出版社, 1994.

[15] 王瑞新，韩富根，杨素勤. 烟草化学品质分析法[M]. 郑州:河南科学技术出版社,1990.

[16] 常剑波，祁春苗，李致新，等. 微生物有机肥对烤后烟叶化学成分和致香物质含量的影响试验[J]. 现代农业科技,2011,2:60-62.

[17] 吴新华，朱瑞芝，任卓英，等. 超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法分离鉴定烟草中5种糖苷类香味前体物质[J]. 色谱,2009,27(6):820-824.

[18] 钟庆辉．烟草化学基本知识[M]. 郑州:轻工业出版社,1985,12(7):75.

[19] 胡皓月，许自成，苏永士，等. 影响烟草新植二烯含量因素的研究进展[J]. 江西农业学报,2010,22(1):17-20.

[20] 李苇苇，戴云辉，吴名剑，等. 烟草中5种糖苷类化合物的液相色谱-质谱联用分析分析[J]. 分析测试学报,2009,28(12):1428-1432.

[21] 曹林海. 云南烤烟GC-MS指纹图谱的建立和应用及HPLC指纹图谱解析研究[D]. 武汉：华中农业大学，硕士学位论文,2012.

[22] 陈振铃，刘百战，罗国安，等. LC-MS/MS在烟草潜香型物质研究中的应用[J]. 南昌大学学报:理学版,2006,30:1390-1391.

[23] 吴新华，朱瑞芝，任卓英，等. 超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法分离鉴定烟草中5种糖苷类香味前体物质[J]. 色谱,2009,27(6):820-824.

[24] Rui Q, Xu L L. Characterization of endopeptidases during wheat leaf senescence[J]. Acta Bot. Sin., 2003, 45: 1049-1054.

[25] 芮 琪，张 鹏，董汉松，等. 小麦叶片衰老期间内肽酶同工酶的变化[J]. 江苏农业学报,2010,26(4):686-690.

[26] 李常军，宫长荣，周义和，等. 烤烟烘烤过程中变黄温度对氮素代谢的影响[J]. 中国烟草学报,2001,7(2):31-35.

[27] 李常军，宫长荣，陈江华，等. 烘烤湿度条件对烟叶氮代谢的影响[J]. 华北农学报,2001, 16(2):141-144.

[28] 谢会雅，朱列书，牛艳丽，等. 利用酶制剂降解烤烟烟叶中淀粉和蛋白质的研究[J]. 中国烟草科学,2008,29(6):23-26.

[29] 姚光明．降低烟叶中蛋白质含量的研究[J]. 烟草科技,2000,9:6-8.

[30] 周冀衡．烟草生理与生物化学[M]. 合肥:中国科学技术大学出版社,1996.

[31] 肖协忠．烟草化学[M]. 北京:中国农业科技出版社,1997.

[32] 苏德成．烟草化学与分析[M]. 北京:中国财政经济出版社,1992.

[33] 李少鹏. 利用生物技术降解烟叶淀粉和蛋白质含量研究[D]. 郑州:河南农业大学,硕士学位论文,2006.

[34] 王 林，朱金峰，许自成，等. 烟草中糖苷类物质的研究进展[J]. 中国农业科技导报,2015,17(1):65-70.

[35] 王 燕. 烟草糖苷类化合物的研究进展[D]. 昆明:昆明理工大学,硕士学位论文,2011.

[36] 苏 菲，周海燕，魏跃伟，等. 不同类型烟草游离态和糖苷结合态中性香气成分含量比较[J]. 河南农业大学报,2012,6(6):1-8.

[37] 周淑平，肖 强，陈叶军，等. 不同生态地区烤烟烟叶中重要致香物质的分析[J]. 中国烟草学报,2004,1:9-16.

[38] 黄正虹，刘钟祥. 曲靖上部烟叶陈化过程中的糖苷类物质的研究[J]. 食品工业,2011,3:50-52.

[39] 朴永革，李元实，崔龙吉，等. 气流干燥对烟丝中糖苷类致香成分的影响[J]. 农产品加工,2004,7:44-47.

Influence of Spraying Different Enzyme Preparations on Chemical Composition, Free and Glycosidic Neutral Aroma Components in Upper Leaves of Flue-cured Tobacco

WANG Lin1, ZHU Jin-feng2, XU Zi-cheng1*, ZHANG Jing-hua1

1.CollegeofTobaccoScience,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;2.LuoheBranchofHenanProvincialTobaccoCompany,HenanLuohe462000,China

In order to study the influence of different enzyme preparation on improving tobacco quality, the experiment was developed by spraying different enzyme preparation on the upper leaves of flue-cured tobacco before baking, and it made the Zhongyan100 as the material. The influence of different enzyme preparation on chemical composition, free neutral and glycosidic aroma components were analyzed. The results showed that different enzyme preparation could reduce the content of protein degradation in different degrees, improve the chemical composition of tobacco leaves, and increase the content of free neutral and glycosidic aroma components. Thus, enzyme preparation had a significant effect on protein degradation, total sugar, reducing sugar and total nitrogen of flue-cured tobacco, but its effect on potassium and chlorine of flue-cured tobacco was not significant. Above all, the mixed enzyme preparation spraying played a better role than the enzyme preparation spraying lonely.

flue-cured tobacco; enzyme preparation; protein; chemical composition; free form; glycosidic form

2015-08-31; 接受日期：2015-09-18

河南省烟草公司科技攻关项目(HYKJ201105；HYKJ201043)资助。

王林，硕士研究生，主要从事烟草栽培与质量评价研究。E-mail:wlin128@126.com。*通信作者：许自成，教授，研究方向为烟草栽培与质量评价研究。E-mail: zcxu@sohu.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.06.10