脑出血患者血清基质金属蛋白酶-9、细胞纤维连接蛋白变化及其相关性研究

张冠妮，杨友松

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.神经外科，b.神经内科，四川 成都 610072)

脑出血患者血清基质金属蛋白酶-9、细胞纤维连接蛋白变化及其相关性研究

张冠妮a，杨友松b

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.神经外科，b.神经内科，四川 成都 610072)

目的 探讨脑出血患者血清基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、细胞纤维连接蛋白(cellular fibronectin，cFN)水平及其与脑血肿和周围水肿体积的关系。方法 收集24例符合入选标准的脑出血患者(脑出血组)，同期健康体检者15例为对照组。测定脑出血组患者发病后1d、3d、7d血清MMP-9、cFN水平；发病当日及5～7d时行头颅CT测定血肿及周围水肿体积，分析MMP-9、cFN水平与脑血肿及周围水肿体积的关系。结果 脑出血组各时间点血清MMP-9、cFN水平明显高于正常对照组(均P< 0.05)，其中发病3d时血清MMP-9、cFN水平升高最明显；MMP-9与出血灶周围水肿体积的绝对值呈正相关，cFN与血肿体积呈正相关(均P< 0.05)；未发现血清MMP-9与cFN两者间有相关性。结论 脑出血患者血清MMP-9及cFN代谢异常，血清MMP-9及cFN水平可间接反映脑出血患者脑组织损伤的严重程度，对其含量测定有助于判断病情。

脑出血；基质金属蛋白酶-9；细胞纤维连接蛋白；脑水肿

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指原发性脑动脉、脑静脉或毛细血管破裂而非外伤等所致的脑实质出血，与缺血性梗塞相比较，其致残率及病死率均较高。发病后脑出血性刺激作为一种损伤因子诱发炎性反应，激活并趋化炎性细胞向损伤处游走，浸润并释放多种生物活性物质，造成组织损伤。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)作为一种蛋白水解酶，在ICH后血-脑屏障(blood brain barrier，BBB)破坏、脑水肿形成过程中的作用已在部分研究[1]中得到证实。细胞纤维连接蛋白(cellular fibronectin，cFN)是血管内皮中的一种糖蛋白，它来源于局部上皮细胞、成纤维细胞、间质细胞及一些肿瘤细胞，有研究表明其升高可能提示有内皮损伤，它在急性脑卒中的变化可能与cFN参与影响血小板功能有关[2]。本研究采用酶联免疫吸附法测定脑出血患者及同期健康体检者血清MMP-9、cFN含量变化，探讨脑出血患者血清MMP-9、cFN水平与脑血肿及周围水肿体积的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院神经内科2007年6月至2008年1月收入院的脑出血患者24例(脑出血组)，其中男10例，女14例；年龄38～80岁[(62±9.82)岁]；基底节区出血15例，脑叶出血6例，小脑出血3例；出血量4.4～26.1 ml[(15.6 ±5.73)ml]。所有患者均有急性起病过程，经头颅CT检查确诊脑出血并确定病变部位及大小范围，符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准，并排除梗死后出血可能，排除糖尿病、肿瘤引起MMP-9、cFN升高的疾病。对照组15例系同期我院体检中心健康体检者，其中男8例，女7例；年龄46～65岁[(56.1±5.44)岁]；均无卒中病史，无高血压、糖尿病、高血脂等其他急慢性疾病者。两组性别、年龄等基线资料比较差异均无统计学意义(P> 0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法 按统一的调查表在急性脑出血患者入院时记录其年龄、性别、高血压病史(年)、意识障碍程度，均进行详细的神经系统检查。所有脑出血患者于入院当时行头颅CT检查，并于入院后5～7天复查头颅CT，以显示脑水肿情况。于入院时、发病后4周行CSS评分，于入院时、发病后3月行改良Rankin量表评分。脑出血组患者分别在发病后第1、3、7天清晨空腹抽取肘静脉血2～3 ml，2500 r/min离心8～10 min，取血清置于-27 ℃冰箱保存待检。对照组清晨空腹采血，标本处理同上。MMP-9试剂盒购于成都精博生物技术有限公司(上海森雄公司生产)；cFN试剂盒购于成都杰纳生物技术有限公司(芬兰Biohit公司生产)。

1.3 观察指标 ①患者发病后1、3、7天的血清MMP-9及cFN水平。②脑血肿及水肿体积：ICH患者入院时(发病24 h内)及发病5～7天头颅CT扫描结果。血肿体积依据第1次CT检查结果计算(多田氏公式)：出血量(ml)=π/6×长(cm)×宽(cm)×高(cm)；总体积(包含血肿体积及水肿带体积)依据第2次CT检查结果计算(多田氏公式)。根据两次CT检查结果计算水肿体积=总体积-发病时血肿体积。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，两独立样本的比较采用t检验，多个样本的比较采用方差分析；相关性分析采用非参数Spearman法。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清MMP-9、cFN水平变化 脑出血组发病1、3、7天时血清MMP-9、cFN水平均高于对照组，差异有统计学意义(P< 0.05)，并且发病3天时血清MMP-9、cFN水平最高，见表1。

表1 血清MMP-9、cFN水平变化

*与对照组比较，P< 0.05

2.2 脑出血患者血清MMP-9、cFN与血肿体积的关系 血清MMP-9水平同血肿体积无相关性(rs1=0.150，rs3=0.095，rs7=0.162，均P> 0.05)；血清cFN水平与血肿体积呈显著正相关(rs1=0.836，rs3=0.939，rs7=0.925，均P< 0.001)。

2.3 脑出血患者血清MMP-9、cFN与出血灶周围水肿体积的关系 血清MMP-9水平与出血灶周围水肿体积呈显著正相关(rs1=0.960，rs3=0.958，rs7=0.966，均P< 0.001)；血清cFN水平与出血灶周围水肿体积无相关性(rs1=0.057，rs3=0.288，rs7=0.272，均P> 0.05)。

2.4 血清MMP-9与cFN的相关性 血清MMP-9与cFN之间无相关性(rs1=0.125，rs3=0.298，rs7=0.329，均P> 0.05)。

3 讨论

ICH后继发性脑损伤的病理生理机制十分复杂，了解其继发性损伤因素，对预防发病及改善预后均有着较为重要的意义。研究表明[3]BBB的损害在ICH后期(24 h后)血管源性脑水肿的形成及继发性损伤中起着重要作用。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是构成血管基底膜的主要成分，它包括IV型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等，在保持BBB完整性方面起主要作用。正常情况下ECM处于产生和降解的动态平衡中，ICH后机体释放出的某些活性物质或血肿本身的成分可能打破这一平衡，从而破坏血脑屏障导致继发性脑损伤。

MMP-9又称IV型胶原酶，是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的一种。其分子量为92 kD，是一种促炎蛋白酶，在体内以无活性的前体(pro-)形式分泌，需经特殊的蛋白酶或自由基激活后，在中性环境中和钙离子参与时发挥活性，其作用底物包括明胶Ⅳ、V型明胶原、弹性蛋白等。在正常脑组织内MMP-9 仅有低水平的表达；在缺血缺氧和炎性因子存在时，血管内皮细胞、小胶质细胞、嗜中性粒细胞、神经细胞等可合成MMP-9，贮存在中性粒细胞和T细胞中的MMP-9也会受到细胞因子和及早因子的刺激而释放。本实验通过对急性脑出血患者不同时期血清中MMP-9含量的测定，发现脑出血患者血清中存在MMP-9代谢异常，其值较正常组显著升高。其发病机理一方面可能是由于血肿直接压迫引起局部血流量下降、组织细胞缺血缺氧，从而刺激炎症细胞、内皮细胞和胶质细胞或在凝血酶、血管内皮生长因子的诱导下，激活MMPs系统导致损伤处MMP-9表达上调[4]；另一方面，由细胞分泌的内源性天然抑制剂TIMP-1 通过与MMP-9 的催化区的可逆性结合来抑制MMP-9 的活性[5]，ICH后过多基质降解，两者之间的平衡关系遭到破坏，也可以使总体上MMP-9的表达或活性增加。本研究还发现患者血清MMP-9的含量与CT所示出血灶周围水肿区体积间呈正相关，其原因可能与过度表达的MMP-9破坏BBB，引发血管源性脑水肿有关[6]。本研究未发现MMP-9同单纯的血肿量间的关系。

cFN是一种多功能的糖蛋白，是构成ECM的主要成分之一。它来源于局部组织中各种细胞如纤维母细胞、软骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞等，并作为一种重要的黏性分子与细胞表面的整合素受体结合，参与细胞的黏附、移行、分化和胞外基质的装配、免疫与炎症反应等多种生理和病理过程。本研究测定了脑出血患者组及对照组血清cFN含量，发现正常人血清中有含量很少的cFN存在，而脑出血患者血清中cFN明显升高，这与Silva的报道相符[7]。其机制可能是由于脑出血血管损伤后，血管内皮下胶原蛋白充分暴露，此时cFN作为一个血小板整合素的配体参与血小板的黏附和聚集反应[8]。本研究还发现，急性脑出血患者病初24 h血清cFN水平即升高，第3天达高峰，随后逐渐下降，虽然其变化过程与临床脑出血患者脑水肿的演变规律相仿，但研究未发现患者血清cFN 的含量与CT 所示出血灶周围水肿区体积间具有相关性。此外，本实验还发现患者血清cFN的含量与脑出血血肿体积呈正相关，这可能是由于血肿压迫周边组织，缺血缺氧加重刺激细胞分泌释放更多cFN以保护机体。这提示我们可将cFN作为判断脑出血患者病情严重程度的临床指标之一，从某种意义上来说cFN依据其与脑血肿有相关性这一特点有可能比MMP-9更早提示脑出血患者病情进展。

以上的研究结果表明MMP-9、cFN均参与了ICH后一系列病理生理改变，ICH后MMP-9及cFN有可能通过破损的血脑屏障进入血液，作为微循环的分子标志物为临床分析提供线索。血清MMP-9及cFN水平可间接反映脑出血患者脑组织损伤的严重程度，早期对其含量测定可辅助CT判断病情。

[1] Florczak-Rzapka M，Grond-Ginsbach C，Montaner J，et al.Matrix metalloproteinases in human spontaneous intracerebral hemorrhage： an update[J].Cerebrovasc Dis，2012，34(4)：249-262.

[2] Makogonenko E，Tsurupa G，Ingham K，et al.Interaction of fibrin(ogen)with fibronectin：further characterization and localization of the fibronectin-binding site[J].Biochemistry，2002，41(25)：7907-7913.

[3] Lee KR，Kawai N，Kim S，et a1.Mechanisms of edema formation after intracerebral hemorrhage：effects of thrombin on cerebral blood flow，blood-brain barrier permeability，and cell survival in a rat model[J].J Neurosurg，1997，86(2)：272-278.

[4] Lee CZ，Xue Z，Zhu Y，et al.Matrix metalloproteinase-9 inhibition atten-uates vascular endothelial growth factor-induced intracerebral hemorr-hage[J].Stroke，2007，38(9)：2563-2568.

[5] Alvarez-Sabin J，Delgado P，Abilleira S，et al.Temporal profile of matrix metalloproteinases and their inhibitors after spontaneous intracerebral hemorrhage：relationship to clinical and radiological outcome[J].Stroke，2004，35(6)：1316-1322.

[6] Li N，Liu YF，Ma L，et al.Association of molecular markers with perihematomal edema and clinical outcome in intracerebral hemorrhage [J].Stroke，2013，44(3)：658-663.

[7] Silva Y，Leira R，Tejada J，et al.Molecular signatures of vascular injury are associated with early growth of intracerebral hemorrhage[J].Stroke，2005，36(1)：86-91.

[8] Lucena S，Arocha Pinango CL，Guerrero B，et al.Fibronectin.Structure and functions associated to hemostasis[J].Invest Clin，2007，48(2)：249-262.

Serum concentrations of matrix metalloproteinase-9 and cellular fibronectin in patients with intracerebral hemorrhage and their clinical significance

ZHANG Guan-nia，YANG You-songb

(a.Department of Neurosurgery，b.Department of Neurology，Sichuan Provincial Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To investigate the dynamic changes of serum levels of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)and cellular fibronectin(cFN)in patients with intracerebral hemorrhage(ICH)and the relationship between the two markers and the volumes of hematoma and perihematomal edema(PHE).Methods Twenty-four ICH patients were confirmed by CT to meet the entry criteria and 15 healthy people were served as controls.Levels of serum MMP-9 and cFN were measured on the day 1，3 and 7 after onset.The volumes of hematoma and its peripheral edema were evaluated by CT on day of onset and 5 to 7 days after onset.The relationship between the two serum markers and the pathological changes were analyzed.Results Levels of serum MMP-9 and cFN were significant higher in ICH patients at each time point after onset than those in normal controls(all P < 0.05).The highest levels of serum MMP-9 and cFN were found on day 3 after onset.The MMP-9 level was positively correlated with PHE while cFN level was positively correlated with hematoma volume.However，no obvious relationship was observed between MMP-9 and cFN levels.Conclusion There is an abnormal metabolism of MMP-9 and cFN in ICH patients.Serum levels of MMP-9 and cFN may reflect the damage severity of brain tissue.It is of helpful to diagnose patients’ conditions.

Intracerebral hemorrhage；Matrix metalloproteinase-9；Cellular fibronectin；Perihematomal edema

四川省卫生厅科研基金资助项目(编号：070079)

R743.34

A

1672-6170(2015)04-0015-03

2014-10-09；

2015-01-05)