三氧化二砷影响人乳腺癌裸鼠移植瘤侵袭性和黏附性Syk机制

周 艳,吴振村,程健君

(1.河北北方学院，河北 张家口 075000；2.河北省张家口市妇幼保健院，河北 张家口 075000)

三氧化二砷影响人乳腺癌裸鼠移植瘤侵袭性和黏附性Syk机制

周 艳1,吴振村2,程健君1

(1.河北北方学院，河北 张家口 075000；2.河北省张家口市妇幼保健院，河北 张家口 075000)

目的 探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,AS2O3)影响人乳腺癌裸鼠移植瘤侵袭性和黏附性Syk作用机制。方法 成功建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型，随机分为实验组(AS2O3)和对照组(生理盐水)。7 d后观察肿瘤体积的变化，流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡情况及两组荷瘤裸鼠肿瘤组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达情况。结果 实验组荷瘤裸鼠肿瘤体积明显低于对照组，差异有统计学意义；实验组荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01)；实验组ICAM-1表达明显高于对照组(P<0.05)；实验组MMP-9表达低于对照组(P<0.05)。结论 AS2O3对人乳腺癌裸鼠移植瘤具有明显的抑瘤作用，可降低肿瘤组织侵袭性增加其黏附性，其作用机制可能与蛋白酪氨酸激酶Syk的表达有关。

三氧化二砷；基质金属蛋白酶-9；细胞间黏附分子-1；Syk

三氧化二砷(arsenic trioxide,AS2O3)是传统中药砒霜的有效成份之一，中医中药治疗恶性肿瘤历史悠久，砒霜作为一种有毒中药在治疗肿瘤中有较好的疗效，抗肿瘤机制是多途径的，例如诱导肿瘤细胞向正常细胞分化；诱导肿瘤细胞凋亡；直接的细胞毒作用；抑制端粒酶活性等[1]。前期实验已证实，As2O3在体外可显著抑制乳腺癌细胞增殖，诱导乳腺癌细胞凋亡，其机制可能与Syk表达增加有关[2]。Syk是新发现的一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，其编码基因为syk，位于人染色体9q22。Syk是乳腺癌细胞生长和转移中重要的抑制因子，本研究采用两株Syk表达不同的人乳腺癌细胞株：MDA-MB-468(Syk阳性表达：Syk+)和MDA-MB-231(Syk阴性表达：Syk-)成功构建人乳腺癌裸鼠移植瘤模型，通过检测肿瘤组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达情况，探讨As2O3影响人乳腺癌裸鼠移植瘤侵袭性和黏附性机制是否与Syk表达有关，以期为临床应用As2O3治疗恶性肿瘤提供应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级纯种BALB/C-nu/nu雌性裸鼠80只，鼠龄4～6周，体质量(18±2) g，购于中国医学科院实验动物研究所，实验动物号Scxk京-2005-0013。

1.1.2 细胞株 人乳腺癌细胞株MDA-MB-468(Syk+)和MDA-MB-231(Syk-)，河北医科大学第四医院科研中心提供。

1.1.3 主要仪器和试剂 超净生物层流架(SSJ-CT-Ⅱ型，上海余山净化设备厂制造)、CO2培养箱(TC2323型，美国SHELDON公司产品)、倒置相差显微镜(LH50A型，日本OLYMPUS)、流式细胞仪(EPICS-XL型，Coulter Co.Healeath，FL)。胎牛血清(杭州四季青)、DMEM和胰蛋白酶(北京碧云天)、鼠抗人Syk单克隆抗体、鼠抗人ICAM-1单克隆抗体、羊抗人MMP-9多克隆抗体(Santa 美国)

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞株MDA-MB-468(Syk+)和MDA-MB-231(Syk-)培养于DMEM培养液(含10%胎牛血清，青霉素和链霉素各100 U·mL-1)中，置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中，隔日换液。实验选用对数生长期的细胞。

1.2.2 人乳腺癌移植瘤模型的建立及分组 随机将实验用80只裸鼠分为两组，每组40只，收集对数生长期的MDA-MB-468(Syk+)和MDA-MB-231(Syk-)细胞，分别调整细胞浓度为1×107/mL，将裸鼠右腋皮下消毒后，每只分别接种0.1 mL肿瘤细胞悬液。移植后裸鼠继续饲养于SPF环境中，接种部位出现肿瘤结节，质地较硬等指标认定为成瘤。成功建立了人乳腺癌荷瘤裸鼠移植瘤模型，80只小鼠在实验过程中均未发生死亡。将接种MDA-MB-468(Syk+)细胞组(A组)和MDA-MB-231(Syk-)细胞组(B组)的荷瘤裸鼠随机再分为阴性对照组(生理盐水)，每组20只裸鼠；实验组(As2O33.0 mg·kg-1)，每组20只裸鼠。每组均经尾静脉注射用药，0.1 mL·d-1，每日一次，连续7 d。

1.2.3 肿瘤生长情况的观察 各组裸鼠在SPF条件下饲养，每日定时用游标卡尺测量移植瘤的大小，分别记录长径和短径，按公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长标准曲线

体积(V)=πab2/6(a代表瘤体的长径，b代表瘤体的短径)

1.2.4 肿瘤组织细胞凋亡及MMP-9和ICAM-1的表达 流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡及MMP-9和ICAM-1的表达情况。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 荷瘤小鼠肿瘤体积的变化

应用As2O3前，各组小鼠之间肿瘤体积差异无显著性(P>0.05)；实验组小鼠应用As2O3后肿瘤体积明显减小，与用药前差异有显著性(P<0.05)，表明AS2O3有抑瘤作用；与阴性对照组相比，差异有显著性(P<0.05)，提示实验组肿瘤生长明显受抑(表1)。

表1 荷瘤小鼠肿瘤体积的变化±s)

注:与A组对照组比较★P<0.05；与B组对照组比较★★P<0.01。

2.2 As2O3对肿瘤组织细胞凋亡的影响

As2O3作用后，采用流式细胞术检测发现A组荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞发生明显的凋亡现象，细胞凋亡率为(49.04±2.20)%，与阴性对照组相比(16.34±1.32)%明显增加，差异有显著性(P<0.01)。B组荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞也发生明显的凋亡现象，细胞凋亡率为(37.85±1.91)%，与阴性对照组相比(9.41±1.12)%差异有显著性(P<0.01)(图1，图2)。且A组实验组荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞凋亡率明显高于B组实验组荷瘤裸鼠，差异有显著性(P<0.01)(表2)。

a b

a b

表2 荷瘤小鼠肿瘤组织细胞凋亡情况比较(%)

2.3 As2O3对肿瘤组织细胞MMP-9和ICAM-1表达的影响

As2O3作用后，A组实验组荷瘤裸鼠肿瘤组织MMP-9表达FI值为1.055±0.19，显著低于对照组1.260±0.28，差异有显著性(P<0.05)；B组实验组荷瘤裸鼠肿瘤组织MMP-9表达FI值为1.278±0.35，显著低于对照组1.681±0.49，差异有显著性(P<0.01)。A组实验组荷瘤裸鼠肿瘤组织中MMP-9表达明显低于B组实验组，差异有显著性(P<0.05)(表3)。

A组实验组荷瘤裸鼠经As2O3作用后，肿瘤组织ICAM-1表达FI值为2.2620±0.54，显著高于对照组1.7790±0.51，差异有统计学意义(P<0.01)；B组实验组荷瘤裸鼠肿瘤组织ICAM-1表达FI值为1.7750±0.45，显著高于对照组1.5000±0.38，差异有统计学意义(P<0.05)。A组实验组荷瘤裸鼠肿瘤组织中ICAM-1表达FI值高于B组实验，差异有显著性(P<0.01)(表4)。

表4 各组肿瘤组织ICAM-1表达比较(FI)

3 讨 论

As2O3是传统中药砒霜的主要成分，因其具有强烈的毒性，长期以来在临床应用十分谨慎。直至上世纪中后期，我国学者使用As2O3治疗急性早幼粒细胞白血病取得巨大成功，引起国内外学者极大关注。近几年的研究发现，As2O3除应用于血液系统恶性肿瘤外，还可抑制多种实体肿瘤，魏玲[3]等研究发现，As2O3可诱导乳腺癌细胞凋亡。研究表明，多途径诱导肿瘤细胞凋亡是As2O3抗肿瘤的主要机制，我们之前研究发现，As2O3诱导人乳腺癌细胞凋亡的作用机制可能与上调Syk表达有关[2]。Syk是新近发现广泛表达于造血细胞的一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，有报道称，Syk是促进乳腺上皮细胞生长的强力因子，在正常乳腺腺体及上皮组织、非侵袭性乳腺癌细胞中很容易检测到Syk的表达，而在侵袭性乳腺癌细胞中则表达降低或缺失[4]。本研究采用Syk表达不同的两株人乳腺癌细胞株成功建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型，结果发现As2O3可抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长，诱导肿瘤细胞凋亡，且接种MDA-MB-468乳腺癌细胞株(syk+)的荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞凋亡率明显高于接种MDA-MB-231(syk-)乳腺癌细胞的荷瘤裸鼠，分析其机制可能与Syk的表达有关。

肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，也是影响治疗结果和预后的重要因素。MMP-9是基质金属蛋白酶家族的一员，是一组锌离子依赖性的内肽酶，是细胞外基质和基底膜降解与重建的关键分子，与肿瘤的侵袭转移密切相关[5]，其表达最相关于人类乳腺癌恶性表型[6]。MMP-9活性和表达的增加与人类乳腺癌的侵袭转移潜能及预后密切相关，MMP-9活性下降在体内、体外均可抑制肿瘤细胞的侵袭力[7]。ICAM-1又称CD54，是免疫球蛋白家族的一种跨膜糖蛋白，介导细胞间黏附，近年来，人们发现它在肿瘤生长及转移方面也起重要作用[8]。在恶性肿瘤细胞中ICAM-1表达升高或降低都有报道，研究显示，ICAM-1基因多态性与口腔癌的发生有相关性[9]；而在小细胞肺癌患者中ICAM-1表达降低[10]。这与肿瘤细胞去分化或调节因子的释放状态有关，一般认为ICAM-1在正常乳腺上皮细胞表达，在乳腺癌细胞株或乳腺组织中表达下降或缺失[11]。ICAM-1表达阴性的肿瘤细胞可减少与细胞毒性淋巴细胞表面LFA-1的结合，帮助乳腺癌细胞逃避机体的免疫监视，使其具有更大的转移潜能和更差的预后[12]。而syk基因作为一个潜在的抑癌基因，其表达减弱或消失也与乳腺癌的侵袭性增强相关[13]。本研究采用流式细胞术检测了As2O3作用前后乳腺癌裸鼠移植瘤组织中MMP-9和ICAM-1的表达，结果提示，As2O3作用后，人乳腺癌裸鼠移植瘤组织MMP-9表达降低而ICAM-1的表达升高，表明As2O3可抑制肿瘤组织的侵袭性增加其黏附性从而降低肿瘤组织的转移性；且接种MDA-MB-468(Syk+)乳腺癌细胞的荷瘤裸鼠肿瘤组织MMP-9表达低于接种MDA-MB-231(Syk-)细胞的荷瘤裸鼠，ICAM-1表达高于接种MDA-MB-231(Syk-)细胞的荷瘤裸鼠，说明As2O3抑制肿瘤组织侵袭性，降低其转移性的机制可能与Syk的表达有关。Syk在肿瘤发生转移中的具体作用机制仍有待于进一步研究。

[1]冉伶,刘文君.三氧化二砷抗肿瘤作用机制研究进展[J].中国医药科学,2012，2(1):39-40.

[2]单保恩,周艳.三氧化二砷抑制人乳腺癌MDA-MB-468细胞生长及其机制的研究[J].癌变·畸变·突变,2007，19(6):0444-0447.

[3]魏玲,王兴武,左文述,等.三氧化二砷抑制人乳腺癌细胞生长及其作用机制的初步研究[J].中华医学杂志,2005，85(17):1209-1213.

[4]Shakeel S,Mahjabeen I,Kayani M A,et al.Association ofsykgenetic variations with breast cancer pathogenesis[J].Asian Pac J Cancer Prev，2013，14(5):3309-3314.

[5]Daniele A,Zito A F,Giannelli G,et al.Expression of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 in sentinel lymph node and serum of patients with metastatic and non-metastatic breast cancer[J].Anticancer Res，2010，30(9):3521-3527.

[6]Nanda D P,Sil H,Moulik S,et al.Matrix metalloproteinase-9 as a potential tumor marker in breast cancer[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol，2013，32(2):115-129.

[7]Aota K,Azuma M.Targeting TNF-α suppresses the production of MMP-9 in human salivary gland cells[J].Arch Oral Biol,2013,58(12):1761-1768.

[8]Yu H S,Lin T H,Tang C H.Involvement of intercellular adhesion molecule-1 up-regulation in bradykin promotes cell motility in human prostate cancers[J].Int J Mol Sci，2013,14(7):13329-45.

[9]Lin C W,Chuang C Y,Tang C H,et al.Combined effects of ICAM-1 single-nucleotide polymorphisms and environmental carcinogens on oral cancer susceptibility and clinicopathologic development[J].J Pone,2013,8(9):121-127.

[10]Kotteas E A,Gkiozos I,Tsagkouli S,et al.Soluble ICAM-1 levels in small-cell lung cancer:Prognostic value for survival and predictive significance for response during chemotherapy[J].Med Oncol,2013,30(3):662.

[11]Zie linski C C,Budingsky A C,Wagner T M U,et al.Defect of tumor necrosis factor-α(TNF-α)production and TNF-α-induced ICAM-1-expression in BRCA-1 mutations carriers[J].Breast Cancer Res Treat,2003;81(2):99-105.

[12]Schr der C,Witzel I,Müller V,et al.Prognostic value of intercellular adhesion molecule(ICAM)-1 expression in breast cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，2011，137(8):1193-1201.

[13]Zhang X,Shrikhande U,Alicie B M,et al.Role of the protein tyrosine kinase Syk in regulating cell-cell adhesion and motility in breast cancer cells[J].Mol Cancer Res，2009，7(5):634-644.

[责任编辑：李蓟龙 英文编辑：谢利峰]

Mechanisms of Arsenic Trioxide on Invasion and Adhesion of Human Breast Cancer Xenograft Tumor in Nude Mice

ZHOU Yan1,WU Zhen-cun2,CHENG Jian-jun1

(1.Hebei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei China;2.Laboratory Department,Maternal and Child Health Hospital,Zhangjiakou,075000,Hebei China)

Objective To explore the mechanisms of arsenic trioxide(As2O3)on invasion and adhesion of human breast cancer xenograft tumor in nude mice.Methods Xenografted breast carcinoma in nude mice was established and the mice models were divided randomly into two groups,namely experimental(treated with AS2O3)and control group(treated with saline).After 7 days,the changes in xenograft tumor volume were measured,and the apoptosis of tumor cells were detected by flow cytometry.The expression of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)and intercellular adhesion molecular-1(ICAM-1)were also detected using flow cytometry.Results The tumor volume of experimental group was significantly reduced compared with that of control group;while the tumor cell apoptosis of experimental group was higher than that of control group(P<0.01);Experimental group showed significantly increased ICAM-1 expression(P<0.05)and reduced MMP-9 expression(P<0.05)compared with control group.Conclusion As2O3could inhibit the growth of human breast cancer in nude mice by decreasing the invasion and increasing the adhesion of tumor,suggesting that the possible mechanisms might associate with the expression of spleen tyrosine kinase(Syk).

arsenic trioxide;metalloproteinase-9;intercellular adhesion molecular-1;spleen tyrosine kinase

河北省教育厅重点科研项目(Z2011208)；河北北方学院青年基金

周艳(1980-),女，河北石家庄人，硕士研究生，主要方向：肿瘤免疫研究。

R 737.9

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2015.02.014

来稿日期：2015-01-10