IL-1β、IL-4在湿热证溃疡性结肠炎大鼠模型中的动态表达及意义

张 歆，柯 晓，陈锦团，高尤亮，周 凡

（1.福建中医药大学临床技能教学中心，福建福州 350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州 350003；3.福建省中医药研究院，福建福州 350003）

◇中医药研究◇

IL-1β、IL-4在湿热证溃疡性结肠炎大鼠模型中的动态表达及意义

张 歆1，柯 晓2，陈锦团1，高尤亮2，周 凡3

（1.福建中医药大学临床技能教学中心，福建福州 350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州 350003；3.福建省中医药研究院，福建福州 350003）

目的 检测IL-1β和IL-4在湿热证溃疡性结肠炎（UC）大鼠血清中的表达，探索其在评价炎症严重程度中的作用及意义。方法 将50只健康SPE级Wistar大鼠（雌雄各半），随机分成5组：正常组及湿热证UC模型Ⅰ（3 d）组、Ⅱ（7 d）组、Ⅲ（14 d）组、Ⅳ（21 d）组，每组均10只大鼠。除正常组在自然环境饲养外，其余各湿热证UC模型组均置于高脂高糖饮食及高温高湿环境中，喂养4周后，用TNBS-乙醇灌肠法诱发湿热证UC。检测各组大鼠疾病活动指数（DAI）、结肠黏膜损伤指数（CMDI）、IL-1β及IL-4含量的变化。结果 与正常组比较，湿热证UC模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠DAI、CMDI、IL-1β含量显著升高（P＜0.01、P＜0.05），模型Ⅱ组升高最为明显（P＜0.01）；血清IL-4含量明显下降（P＜0.01、P＜0.05），模型Ⅱ组下降最为明显（P＜0.01）；模型Ⅳ组上述指标均无统计学差异（P＞0.05）。结论 在湿热型UC发病过程中炎性细胞因子IL-1β、IL-4参与了其发病过程，且IL-1β上升及IL-4下降水平同炎症严重程度在时间上是一致的，可作为炎症严重程度的评价指标。

湿热；溃疡性结肠炎；疾病活动指数（DAI）；结肠黏膜损伤指数（CMDI）；IL-1β；IL-4

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因及发病机制尚不明确的直肠和结肠慢性、反复发作性、非特异性肠道炎症疾病［1］。中医将其归入泄泻、痢疾等范畴，治疗上多采用辨证施治的原则，根据相应的证型选用不同的方药。研究表明，大肠湿热证是UC的临床中医证型中以最为常见的一种［2］。肠道黏膜免疫系统中促炎细胞因子与抗炎细胞因子的失衡被认为是UC的重要发病机制，二者的平衡对于炎性反应程度与临床预后有重要的意义［3］。因此，本实验应用高脂高糖饮食及高温高湿环境结合TNBS-乙醇灌肠法诱发湿热型UC，通过检测大鼠疾病活动指数、组织大体形态学评分、IL-1β及IL-4的变化，为临床应用提供新的科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康SPE级Wistar大鼠50只，雌雄各半，体质量200～240 g，由福建中医药大学实验动物中心提供，购于上海市斯克莱实验动物有限责任公司［许可证号码：SCXK（沪）2007-0005号］。

1.2 药品与试剂三硝基苯磺酸（TNBS），Sigma公司提供；便隐血（OB）试剂盒，珠海贝索生物技术有限公司提供；IL-1β、IL-4检测试剂盒购于上海BV公司。

1.3 主要仪器设备酶标仪（MK3型）（芬兰雷勃公司）；人工气候箱（LRH-800-G型）（广东省韶关市泰宏医疗器械有限公司）。

1.4 动物分组及模型复制将50只健康SPE级Wistar大鼠（雌雄各半）随机分成5组：正常组、湿热证UC模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，每组均10只大鼠。除正常组在自然环境［室内温度（26±2）℃，相对湿度45%～60%，普通饲料］饲养外，其余各湿热证UC模型组均置于高脂高糖饮食（糖15%、猪油10%、胆固醇4%、胆盐0.3%、蛋黄粉10%、基础饲料60.7%）及高温（32±2）℃、高湿（95±2）%环境中，每日持续20 h。喂养4周后，用TNBS-乙醇灌肠法诱发湿热型UC：给予腹腔注射100 g/L水合氯醛3 m L/kg进行麻醉，麻醉后使用直径约为2 mm的硅胶管（可用7#头皮针剪去针头部分）灌肠，注入1 m L灌肠液（含100 mg TNBS 0.75 m L+500 m L/L乙醇0.25 m L），捏紧肛门并将大鼠臀部倾斜朝上约15 min，以防倒流；正常组同法灌入生理盐水1 m L，让动物保持平躺至自然清醒。在第3、7、14、21天时，分别处死模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组大鼠并取材，检测大鼠疾病活动指数、组织大体形态学评分、IL-1β及IL-4的变化。

1.5 指标检测

1.5.1 一般情况 包括体质量、饮食、饮水、大便、毛发、活动、精神状态等。

1.5.2 疾病活动指数（disease activity index，DAI）

造模后，观察记录大鼠的体质量、腹泻和便血等临床体征。参照JACKSON等［4］的方法计算（表1）。

表1 DAI的计算方法Tab.1 DAI calculation method

1.5.3 结肠黏膜损伤指数（colonic mucosa damage index，CMDI）评分 选取距肛门2.0 cm以上的结肠，沿肠系膜缘纵轴剪开肠腔，冰生理盐水冲净肠黏膜表面粘附物，选取结肠组织病变明显处，于10倍放大镜下观察。参照BUTZER等［5］方法，根据粘连程度和炎症、溃疡形成情况进行结肠黏膜大体形态损伤评分。粘连：0分无，1分轻度（结肠与其他组织剥离较易），2分重度；溃疡形成及炎症：0分无，1分局部充血无溃疡，2分l处溃疡不伴充血或肠壁增厚，3分l处溃疡伴炎症，4分大于2处溃疡伴炎症，5分大于2处溃疡和/或炎症大于1 cm，6～8分溃疡和/或炎症大于2 cm，病变范围每增加1 cm，计分加1分。留取结肠标本分别用于HE染色。

1.5.4 血清IL-1β、IL-4检测 所有大鼠末次给药后，禁食不禁水24 h，给予100 g/L水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血约5 m L，置于无菌试管中静置2 h，以4 000 r/min离心10 min，留取血清待检，-20℃冰箱待测。ELISA法测定各组大鼠血清IL-1β及IL-4的变化情况，检测时严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 统计学处理用SPSS 17.0对数据进行统计学分析。检测结果以¯x±表示，多组样本采用单因素方差分析，当方差齐时，两两比较选用LSD-t检验法；当方差不齐时，选用Tamhane-t检验法；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠的一般情况正常组大鼠体质量稳步增加，饮食饮水正常，大便呈颗粒状，毛色光泽，动作敏捷，反应灵敏，精神状态良好。各造模组大鼠前10 d体质量增加较快，后期变缓，懒动，毛发无华，大便黏滞不爽，粪色加深，尿黄，尿少。给予TNBS-乙醇灌肠后第1天均出现懒动、扎堆、弓背蜷卧、毛发晦暗无泽、饮食饮水减少、稀便，且部分大鼠出现潜血阳性或肉眼可见黏液脓血便，肛周体毛沾染痕迹多见；第3天体质量开始下降，懒动、扎堆现象较多；第7天体质量下降明显，毛色无泽，饮食饮水低于正常，仍有稀便，部分大鼠仍为潜血阳性或肉眼可见黏液脓血便；第14天大鼠活动正常，仍有稀便，部分大鼠仍可见潜血阳性；第21天时大鼠毛色晦暗，饮食饮水趋于正常，偶有稀便。模型Ⅰ组于造模后第1天死亡1只，模型Ⅱ组于造模后第2天和第4天各死亡1只，模型Ⅲ组于造模后第1天死亡1只，模型Ⅳ组于造模后第3天死亡1只；正常组大鼠无死亡发生。

2.2 大鼠结肠黏膜情况

2.2.1 结肠肉眼观 正常组结肠黏膜颜色呈现淡粉色，黏膜皱襞纹理清晰，表面光滑，未见明显的充血、糜烂；模型Ⅰ组大鼠肠壁增厚，水肿明显，肠腔黏膜充血点散在，溃疡形成；模型Ⅱ组肠道黏膜颜色发黑，并有多处糜烂、溃疡，结肠缩短，严重者可见肠穿孔；模型Ⅲ组溃疡开始愈合，大鼠肠道仍然有粘连，偶可见肠胀气；模型Ⅳ组可见少量糜烂，无溃疡或可见溃疡愈合的瘢痕。

2.2.2 结肠组织病理变化 正常组结肠黏膜完整，无溃疡及糜烂形成。模型Ⅰ组大鼠肠黏膜充血，溃疡形成，上皮细胞水肿、坏死，结肠全层增厚并可见大量炎症细胞浸润；模型Ⅱ组肠黏膜萎缩变薄，部分缺损、糜烂，且深达肌层，边缘腺体坏死；模型Ⅲ组肠黏膜充血、水肿减轻，溃疡变浅，散在炎症细胞浸润，肉芽组织增生；模型Ⅳ组肠黏膜相对完整，部分腺体破碎，周围上皮下固有层中腺体增生且结构清晰、分泌活跃，肌层完整未见明显异常（图1）。

2.3 各组大鼠DAI、CMDI、血清IL-1β及IL-4的比较与正常组比较，湿热证UC模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠DAI、CMDI、IL-1β含量明显升高（P＜0.01、P＜0.05），模型Ⅱ组升高最为明显（P＜0.01），模型Ⅰ、Ⅲ组升高较为明显（P＜0.05），模型Ⅳ组尽管仍有所升高，但无统计学差异（P＞0.05）；湿热证UC模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠IL-4含量明显下降（P＜0.01、P＜0.05），模型Ⅱ组降低最为明显（P＜0.01），模型Ⅰ、Ⅲ组降低较为明显（P＜0.05），模型Ⅳ组尽管仍有所降低，但无统计学差异（P＞0.05，表2）。

图1 各组大鼠结肠组织的病理变化Eig.1 Pathological changes of colon tissue in each group（HE，×100）

表2 各组大鼠DAI、CMDI及血清IL-1β、IL-4的比较Tab.2 Comparison of DAI，CMDI and serum IL-1βand IL-4 in each group （±s）

表2 各组大鼠DAI、CMDI及血清IL-1β、IL-4的比较Tab.2 Comparison of DAI，CMDI and serum IL-1βand IL-4 in each group （±s）

与正常组比较，*P＜0.01，△P＜0.05。

组别例数DAI CMDI IL-1β（pg/mL）IL-4（pg/mL）正常组10 0.53±0.32 0.66±0.28 53.55±14.95 137.16±18.47模型Ⅰ组9 1.00±0.37△1.16±0.40△67.39±11.17△119.81±11.62△模型Ⅱ组8 3.17±0.31*3.54±0.49*79.38±7.79*97.50±10.76*模型Ⅲ组9 0.93±0.47△1.05±0.54△65.87±10.68△122.52±7.05△模型Ⅳ组0.59±0.46 0.81±0.26 56.7±16.59 132.21±15.42 9

3 讨 论

UC是一种发病机制尚未完全明确的慢性非特异性结肠炎症性疾病，且有癌变可能，近年来发病率和癌变率有明显提高［6］。本病源于湿热之邪蕴于大肠，与肠中气血相搏结，致胃肠血络受伤，气血运行不畅，肠道传导失司，肠络受损，气血凝滞，化腐成脓而出现黏液脓血便。辨证论治是中医药理论体系的精髓，医家对本病的分型存在着诸多见解。李乾构［7］对60篇文献进行统计分析后总结临床分型可达42种，其出现顺序依次为大肠湿热型、脾虚湿热型、脾胃虚弱型、脾肾阳虚型等。赵婕［8］对近10年文献进行分类研究，发现UC大致可分为：大肠湿热证、脾虚湿热证、脾胃虚弱证、脾肾阳虚证、肝郁脾虚证、气滞血瘀证、寒热错杂证等。可见对于UC的中医辩证分型不统一，缺乏合理的辩证分型标准，目前影响力较大的是中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会于2011在《溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识》［9］中颁布的，该共识将UC分为大肠湿热证、脾气虚弱证、脾肾阳虚证、肝郁脾虚证、寒热错杂证、热毒炽盛证。但患者所表现的证候往往错综复杂，标准在临床上的运用并不令人满意。尽管分型不一，各类研究均表明大肠湿热证在UC临床中医证型中以最为常见。吕永慧等［10］对110例UC患者进行中医证型分布的研究，发现大肠湿热证所占比例居首；赵新芳等［11］对60例UC进行内镜表现与中医辨证分型之间的研究表明，大肠湿热型占55%，肝郁脾虚型占15%，血瘀肠络占7%，脾胃气虚型占3%，可见大肠湿热为主要临床证型。本研究是通过高脂高糖饮食及高温高湿环境构建湿热证大鼠模型，再结合TNBS-乙醇灌肠法诱发湿热型UC，这是一种目前应用较为广泛的构建湿热证大鼠UC模型造模方案［12-13］。从本实验的结果来看，各造模组大鼠出现体质量先增后降，懒动，毛发无华，大便黏滞不爽，粪色加深，尿黄、尿少等与人类湿热证表现相似的症状。应用TNBS-乙醇灌肠后，大鼠出现潜血阳性或肉眼可见黏液脓血便，而结肠肉眼及镜下均可见糜烂、溃疡等溃疡性结肠炎的症状，均可说明该法复制的湿热证大鼠UC模型是成功的。

众多研究表明，细胞因子在UC的发生、发展和转归的过程中，通过调节肠道炎症免疫反应而使炎症加重并持续存在，并引起肠组织慢性损伤，而肠道黏膜免疫系统中促炎细胞因子与抗炎细胞因子的失衡被认为是UC的重要发病机制。因此，本研究选取了促炎细胞因子IL-1β及IL-4抗炎细胞因子作为检测指标，来探讨其在湿热证UC模型中的意义。

IL-1β与UC的发病密切相关［14］，它能介导UC早期的炎症反应，刺激其它细胞因子和炎症介质产生，还能反馈性地促进巨噬细胞和T淋巴细胞产生IL-2等表达进而加速炎症反应，共同促进炎症活性。IL-1β还可通过促进白细胞粘附分子的表达，使趋化中性粒细胞等炎性细胞进入肠道病变部位，引发肠组织破坏和肠道的炎症反应［15］。钟江鹏等［16］指出，UC患者结肠黏膜中IL-1β在UC活动期明显升高。张凯等［17］发现IL-1β在UC患者血清中水平随着病情严重程度逐渐增加。曹秀红等［18］研究也表明UC结肠黏膜组织中IL-1β水平可作为UC严重程度及疗效的判断指标。IL-4是一种重要的抗炎因子，主要由活化的巨噬细胞和淋巴细胞分泌，它能抑制单核巨噬细胞产生IL-1β、IL-6、IL-8和TNE-α等，并促进白细胞介素-1受体抗体（IL-1RA）的产生，提高IL-1RA/IL-1β的比例，在维持肠道免疫、抑制和消除肠道炎症反应中发挥着非常重要的作用。WANG等［19］指出，IL-4在UC模型组的表达低于正常组；HUANG等［20］的研究也印证了这一点。岳文杰等［21］发现，IL-4不仅参与了UC的发病，并且其在肠黏膜局部的表达水平与疾病活动度呈正相关；林巧嫦等［22］研究也表明，UC患者IL-4浓度在不同分期、不同病情程度的差异有统计学意义。因而，IL-4的表达水平可用于评估UC的严重程度。正常状态下，人体肠黏膜能自发的分泌抗炎因子如IL-4来维持肠道免疫，IL-1β则分泌较少或不分泌，二者之间维持着动态平衡，当遇到病原刺激后，则这种平衡遭到破坏，使促炎因子升高，抗炎因子降低，导致肠道炎症发生。UC发生时，血清IL-1β升高、IL-4降低，已在临床及实验研究中得到了证实［23-24］。张学兰［25］还揭示了促炎因子IL-1β随着病情程度和病理分级升高而显著升高，抗炎因子IL-4随着病情程度和病理分级升高而显著降低。

本实验结果显示，与正常组比较，湿热证UC模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠IL-1β含量明显升高（P＜0.01、P＜0.05），IL-4含量明显下降，表明促炎因子IL-1β与抗炎因子IL-4的失衡和UC的发病密切相关；模型Ⅱ组IL-1β升高、IL-4下降均最为明显（P＜0.01），表明此时肠黏膜炎性细胞因子失衡最为严重；模型Ⅰ、Ⅲ组IL-1β及IL-4的表达均说明炎症处于发展或恢复阶段，而模型Ⅳ组与正常组无统计学差异（P＞0.05），则说明肠黏膜炎性细胞因子平衡已经恢复，体现了机体自我调节和自我愈合能力。而DAI、CMDI结果也与上述结论一致。本实验也证实抗炎和促炎细胞因子的失衡参与了UC的发病，因而从纠正肠道异常免疫反应角度探讨UC药物治疗是一个重要思路。

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（编辑 卓选鹏）

The dynamic expression and significance of IL-1βand IL-4 in ulcerative colitis rats with damp-heat syndrome

ZHANG Xin1，KE Xiao2，CHEN Jin-tuan1，GAO You-liang2，ZHOU Ean3
（1.Clinical Skills Teaching Center，Eujian University of Traditional Chinese Medicine，Euzhou 350122；2.the Second Affiliated Hospital，Eujian University of Traditional Chinese Medicine，Euzhou 350003；3.Eujian Institute of Chinese Medicine，Euzhou 350003，China）

Objective To study the expressions of serum interleukin-1β（IL-1β）and interleukin-4（IL-4）in ulcerative colitis（UC）rats with damp-heat syndrome and explore their significance in assessing inflammatory severity.Methods We randomly divided 50 healthy Wistar rats of SPF grade（half males and half females）into normal group，and damp-heat syndrome model of UCⅠ（3 days），Ⅱ（7 days），Ⅲ（14 days）andⅣ（21 days）groups，with 10 in each group.Rats in normal group were raised in the natural environment of breeding，while those UC model groups with damp-heat syndrome were fed with high-sugar and high-fat food in the high-temperature and high-humidity environment for 4 weeks.The rat model of damp heat syndrome UC was established by using TNBS-ethanol enema.Then we detected the changes of disease activity index（DAI），colonic mucosa damage index（CMDI），IL-1βand IL-4 in each group.Results Compared with those in normal control group，DAI，CMDI and IL-1βlevels in damp heat syndrome UC modelⅠ，Ⅱ，Ⅲgroups were significantly increased（P＜0.01，P＜0.05），with model groupⅡhaving the most obvious increase（P＜0.01）.Serum IL-4 level decreased significantly（P＜0.01，P＜0.05），with model groupⅡhaving the most significant decrease（P＜0.01）.The above indexes did not significantly differ in model groupⅣ（P＞0.05）.Conclusion Inflammatory cytokines IL-1βand IL-4 are involved in the pathogenesis of damp-heat syndrome UC.The increased IL-1βand decreased IL-4levels are consistentwith the time of inflammatory severity；therefore，they can be regarded as markers for assessing inflammatory severity in UC.

damp-heat syndrome；ulcerative colitis；disease activity index；colonic mucosa damage index；interleukin-1β；interleukin-4

R574.62

A

10.7652/jdyxb201505024

2014-09-22

2015-04-14

福建省自然科学基金项目（No.2011J01194），福建省中医药科研项目计划项目（No.wzpw201309），福建中医药大学校管课题（No.X2012030）Supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province（No.2011J01194），Fujian Province TCM Research Project（No. wzpw201309），and Fujian University of Traditional Chinese Medicine Project（No.X2012030）

柯晓.E-mail：drkxkx@163.com

优先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150717.1112.008.html（2015-07-17）