亚低温联合μ-阿片受体激动剂对家兔心肺复苏后心功能的保护作用

张立平，李培杰，曹 雯，张正义，罗延年

（兰州大学附属第二医院ICU，甘肃兰州 730030）

亚低温联合μ-阿片受体激动剂对家兔心肺复苏后心功能的保护作用

张立平，李培杰，曹 雯，张正义，罗延年

（兰州大学附属第二医院ICU，甘肃兰州 730030）

目的 研究亚低温联合μ-阿片受体激动剂对家兔心肺复苏后心功能的保护作用，并探讨其可能的机制。方法 体外致颤法建立家兔心肺复苏模型，随机分为常规复苏组（B组）、亚低温复苏组（C组）、瑞芬太尼复苏组（D组）、亚低温联合瑞芬太尼复苏组（E组），并设对照组（A组，仅行麻醉、手术、气管插管，但不致颤）。测定各组不同时间点左室舒张末压（LVEDP）、左室内压上升和下降最大速率（peak±dp/dt）及血清COX2、H-EABP浓度，并于复苏后4 h处死动物，观察心肌细胞ICAM-1的表达情况以评价心功能的变化。结果 ①与A组比较，其余4组LVEDP与peak±dp/dt在复苏成功30 min差异有统计学意义（P＜0.01）；C、D、E组与B组比较，分别在复苏成功120、60 min时差异有统计学意义（P＜0.05），但E组LVEDP升高幅度以及peak±dp/dt下降幅度均小于C、D组（P＜0.05）；C、D两组差异无统计学意义。②与A组比较，其余4组血清H-EABP与COX-2值明显升高（P＜0.01）；C、D、E组较B组明显降低，但E组下降幅度最为明显（P＜0.05）；③A组心肌细胞未见ICAM-1表达阳性细胞，B组可见大量阳性细胞，C、D组较B组阳性细胞减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；E组较C、D组阳性细胞明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 亚低温治疗及瑞芬太尼干预均可改善心肺复苏后心功能不全，两者联用可提高疗效，具有协同功效。该疗效可能是通过延长亚低温治疗时间窗，更加有效地发挥瑞芬太尼和亚低温的自由基清除及抑制炎症反应作用而达到心肌保护作用。

亚低温；瑞芬太尼；心肺复苏；心功能；COX2；H-EABP；ICAM-1

随着心肺复苏技术的提高，心搏骤停后自主循环恢复（restoration of spontaneous circulation，ROSC）率达40%～60%，但最终出院率仅10%［1］，复苏后综合征是影响其生存率的独立危险因素。复苏后综合征的治疗包括非药物性治疗（如亚低温）和药物性治疗（如阿片受体激动剂、钙通道阻滞剂和自由基清除剂等）。动物实验和临床研究表明，亚低温和阿片受体激动剂对心肺复苏后心肌具有肯定的保护作用，能改善近期和远期的预后，具有良好的应用前景［2］。但目前尚无二者联用的实验研究。本研究通过对亚低温联合瑞芬太尼治疗心肺复苏后家兔心功能的观察，评价其心脏保护作用及可能的机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 心肺复苏动物模型的制备健康清洁级家兔30只，雌雄不拘，体质量2.0～2.5 kg，由兰州大学医学实验中心提供。术前12 h禁食不禁水，家兔麻醉后仰卧固定，建立静脉通路，心电监护。气管插管，自由呼吸室内空气，分离右颈总动脉，将PE导管插入左室，通过压力换能器与多导生理监护仪连接测定血流动力学指标，分离右股动脉插入导管测定平均动脉压（MAP）及采取血液标本。肛门直肠温度探头监测肛温。心肺复苏动物模型参照文献［3］方法。采用体外电击诱发室颤动物模型，50 V交流电持续放电5 s，必要时可反复进行，直至ECG示室颤（VE）波形及MAP＜20 mm Hg。室颤持续3 min后开始心肺复苏，人工胸外心脏按压，按压频率200次/min，按压深度为兔胸廓前后径的1/3，同时给予机械通气（EiO21.0，通气频率12次/min，潮气量15 m L/kg）。胸外按压2 min后，必要时给予1次30 J单相波电除颤，之后持续心前区按压2 min，如仍为VE再以同样能量电除颤，如此反复3次为1轮。15 min后自主循环仍未恢复视为复苏失败。ROSC标准：出现室上性自主心律、平均动脉压≥60 mm Hg并持续5 min。

1.2 亚低温实施方法通过左颈外静脉导管以1.0 mg/（kg·h）速度滴注4℃9 g/L生理盐水（NS），同时配合体表降温（碎冰置于中空手术台内，冰量按100 g/100 mg体质量），要求15 min内家兔肛温降至32～34℃，同时实验过程中动态监测肛温，维持32～34℃至实验结束。

1.3 实验分组所有成模家兔随机分为5组（n= 6）：对照组（A组），仅行麻醉、手术、气管插管，但不致颤；常规复苏组（B组），常规心肺复苏，复苏时使用标准剂量肾上腺素（30μg/kg，上海禾丰制药有限公司，规格10 mg/m L，批号091201）；亚低温复苏组（C组），ROSC后快速诱导亚低温；瑞芬太尼复苏组（D组），ROSC后输注瑞芬太尼（宜昌人福药业有限公司，规格1.0 mg/玻璃管制注射剂瓶，批号H20030199）6μg/（kg·min），至实验结束；亚低温联合瑞芬太尼复苏组（E组），ROSC后快速诱导亚低温同时静脉输注瑞芬太尼6μg/（kg·min），至实验结束。

1.4 检测项目及方法

1.4.1 血流动力学观察 采用BL-420E生物机能实验系统，分别在致颤前15 min及复苏后30、60、120、180、240 min时间点测定并记录左室舒张末压（LVEDP）、左室内压上升和下降最大速率（peak±dp/dt）等数据。

1.4.2 心型脂肪酸结合蛋白（H-EABP）及COX-2含量测定 上述时间点自家兔右股动脉采血1.5 mL共2份，分别注入3 mL离心管静置20 min后，放置离心机，以3 000 r/min离心15 min，取血清置-70℃保存。一份采用酶联免疫吸附法（ELISA）进行H-EABP定量分析，另一份采用放免法按试剂盒进行COX-2定量分析。

1.4.3 细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的表达测定监测4 h后，腹腔注射戊巴比妥150 mg/kg处死动物，取心肌组织以免疫组化法测定ICAM-1的表达。采用病理分析前数据报告系统对免疫组化结果进行定量分析：在400倍视野下随机选取10个视野（保证不重叠），共计数100个心肌细胞。染色明显且胞膜阳性的细胞数占75%以上的以“+++”表示，染色中等且阳性细胞占50%～75%的以“++”表示，染色轻度且阳性细胞占10%～50%的以“+”表示，细胞膜无染色或者阳性细胞数＜10%则以“-”表示。

1.5 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多个样本均数的比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），基于时间测量各组数据采用重复测量设计资料的方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，各组ICAM-1表达计数以百分率表示，采用多组等级资料秩和检验进行比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组心肺复苏情况除常规复苏组及亚低温复苏组各1只家兔因手术意外死亡外，其余家兔均复苏成功并且观察复苏后4 h至实验结束。

图1 各组家兔心肺复苏前后LVEDP的变化趋势Eig.1 The trend of LVEDP changes at different time points in each rabbit group

2.2 各组复苏前后血流动力学变化致颤前各组动物血流动力学指标无差异（P＞0.05）。与致颤前相比，B、C、D、E组LVEDP及peak±dp/dt在复苏成功后各时间点均有不同程度升高及降低（P均＜0.01）。与A组比较，其余4组LVEDP与peak±dp/dt在复苏成功后30 min差异有统计学意义（P均＜0.01）；与B组比较，C、D、E组LVEDP与peak±dp/dt分别在复苏成功后60、120 min差异有统计学意义（P＜0.05），但E组LVEDP升高幅度以及peak±dp/dt下降幅度均小于C、D各组（P＜0.05，图1、图2）。

2.3 各组复苏前后H-FABP及COX-2质量浓度的变化 见表1。致颤前各组H-EABP值差异无统计学意义（P＞0.05）。与A组比较，其余4组H-EABP值均在复苏成功后60 min达峰值，且明显升高（P＜0.01）；此后各时间点，与B组比较，C、D、E组血清H-EABP值明显降低，但E组下降幅度最为明显（P＜0.05）。致颤前各组COX-2值差异无统计学意义（P＞0.05）。与A组比较，其余4组COX-2值均在复苏成功后120 min达峰值，且明显升高（P＜0.01）；与B组比较，此后各时间点C、D、E组COX-2值明显降低，但E组下降幅度最为明显（P＜0.05）。

图2 各组家兔心肺复苏前后±dp/dt的变化趋势Eig.2 The trend of±dp/dt changes at different time points in each rabbit group

表1 各组家兔心肺复苏前后H-FABP与COX-2质量浓度的变化Tab.1 Comparison of H-EABP and COX-2 concentrations at different time points in each rabbit group（±s，pg/m L）

表1 各组家兔心肺复苏前后H-FABP与COX-2质量浓度的变化Tab.1 Comparison of H-EABP and COX-2 concentrations at different time points in each rabbit group（±s，pg/m L）

A组：对照组；B组：常规复苏组；C组：亚低温复苏组；D组：瑞芬太尼复苏组；E组：亚低温联合瑞芬太尼复苏组。同一时间点与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别H-EABP致颤前30 min 60 min 120 min 180 min 240 min A 638.76±20.64 625.60±23.61 634.08±27.91 619.77±24.21 627.99±20.45 623.79±24.71 B 634.76±20.64 815.60±23.61**932.08±30.91**863.77±30.21**792.99±20.45**758.79±24.71**C 624.43±22.54 778.82±31.67**▲885.80±26.97**▲813.79±26.83**▲764.44±23.31**▲729.12±17.85*▲▲D 632.48±22.76 756.32±27.06**▲849.45±27.56**▲796.38±20.67**▲731.39±19.36*▲▲702.86±25.34*▲▲E 615.44±23.03 739.65±29.28*▲▲834.22±19.91**▲769.82±27.97**▲733.85±20.49*▲▲701.75±29.86*▲▲组别COX-2致颤前30 min 60 min 120 min 180 min 240 min A 66.47±2.53 61.51±7.47 59.47±3.64 58.73±5.06 65.47±4.34 66.47±1.15 B 63.82±5.34 126.23±4.45**138.89±6.47**154.94±7.84**140.78±4.93**135.67±9.26**C 64.12±3.06 101.86±5.81**▲112.73±4.76**▲139.69±5.67**▲121.97±6.25**▲110.90±7.34**▲D 61.59±4.75 113.59±3.25**▲103.17±1.94**▲120.47±6.21**▲102.73±5.12**▲98.49±6.23*▲▲E 59.64±4.75 98.29±7.75*▲90.59±3.43*▲101.59±7.45**▲89.59±4.81*▲▲79.84±6.39*▲▲

图3 各组家兔心肺复苏后心肌ICAM-1蛋白的免疫组化检测结果Eig.3 Expression of ICAM-1 protein in postresuscitation myocardium in each rabbit group（×400）

2.4 各组复苏后ICAM-1的表达情况免疫组化法显示ICAM-1阳性细胞为细胞膜和（或）胞质染色呈棕褐色颗粒。A组未见ICAM-1阳性细胞；B组可见大量的ICAM-1阳性细胞；C、D组较B组阳性细胞减少；与C、D组相比，E组ICAM-1阳性细胞减少（图3）。各组心肌ICAM-1蛋白表达统计学处理结果显示，与B组比较，C、D组复苏后ICAM-1蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05）；与C、D组比较，E组复苏后ICAM-1蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2 各组心肺复苏后心肌ICAM-1蛋白表达的变化Tab.2 Expression of ICAM-1 protein

3 讨 论

复苏后综合征是导致心肺复苏后心功能障碍及出院存活率低的重要原因。尽管大量实验表明，亚低温和心肌保护药物对复苏后综合症治疗有效，但二者联用的相关研究不多［4］。考虑其原因可能是亚低温影响心肌保护药物的排泄作用及其代谢产物而加重缺血再灌注后肝肾功能损伤［4］。有文献报道瑞芬太尼对心肌有保护作用［5-6］，它是一种新型阿片μ受体激动药，其代谢不受肝、肾功能影响。本实验选择亚低温联合瑞芬太尼，以期在不造成肝肾功能损害的基础上，研究二者联合对家兔心肺复苏后心功能的影响。

目前研究发现，亚低温与深度低温疗效相同，而其副作用明显减少［7-8］，32～34℃亚低温治疗已广泛应用于临床。本实验结果显示，虽然亚低温复苏组与肾上腺素复苏组复苏后心脏收缩功能指标peak± dp/dt均升高，舒张功能指标LVEDP均减低，心肌损伤标志物H-EABP值均有迅速升高，且整个复苏后观察期都高于基础值，但亚低温复苏组LVEDP、peak±dp/dt、H-EABP浓度升高及减低幅度明显低于肾上腺素组，差异有统计学意义（P＜0.05）。这说明亚低温可以稳定心搏骤停患者的血流动力学并能减轻心肺复苏后心肌的损害，这与JACOBSHAGEN等［9-10］实验结果一致。有研究表明，瑞芬太尼预处理对缺血再灌注后心肌具有保护作用，后处理效果不明显或者无效，其原因可能是瑞芬太尼心肌保护作用呈剂量依赖性［11］。和研究瑞芬太尼预处理一样，研究后处理疗效的实验多是使用麻醉镇痛剂量的瑞芬太尼［0.25～1μg/（kg·min）］，而此剂量通常对缺血再灌注后心肌无效或作用不显著。本实验在缺血再灌注后应用6μg/（kg·min）瑞芬太尼，结果显示，瑞芬太尼复苏组和亚低温复苏组peak±dp/dt、LVEDP值与肾上腺复苏组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。瑞芬太尼复苏组和亚低温复苏组H-EABP浓度升高幅度明显低于肾上腺素组。这说明瑞芬太尼复苏组复苏后心肌功能明显优于肾上腺复苏组，瑞芬太尼后处理具有心肌保护作用，这与WONG等［6］的研究一致。本实验中，C、D、E组peak±dp/dt及LVEDP指标都优于B组，但以E组改善最为明显；C、D两组血清H-EABP浓度显著低于B组（P均＜0.05），E组血清H-EABP浓度较C组及D组进一步减少（P均＜0.05）。这提示亚低温和瑞芬太尼对心肺复苏后心肌具有肯定的保护作用，两者联用具有协同功效，能进一步提高疗效。

ICAM-1是20世纪80年代末发现的一种细胞粘附分子［12］。在生理情况下，心肌细胞只表达极少量的ICAM-1，在某些病理因素下如心脏缺血再灌注、心脏移植术后以及TNE-α、IL-8、IL-6、LPS等炎症因子刺激下，ICAM-1表达量可成倍增加，参与介导中性粒细胞对缺血/再灌注心肌的损伤作用。因此，抑制ICAM-1的表达可以抑制中性粒细胞向缺血区内皮细胞和心肌细胞的浸润，减轻心肌损伤，保护心肌。本实验证实亚低温联合瑞芬太尼对阻断ICAM-1在心肌细胞的表达效果更好。心肌缺血再灌注后数分钟，氧自由基大量产生造成心肌损伤，环氧合酶（cyclooxygenase）是体内花生四烯酸代谢过程中最主要的限速酶，存在原生型（COX-1）和诱导型（COX-2）两种亚型。研究表明，COX-2与心血管疾病关系密切，虽然在正常心脏中几乎检测不到COX-2，但在心肌缺血梗死、扩张型心肌病、动脉粥样硬化、慢性心衰等心血管疾病中COX-2表达上调。本实验结果显示，亚低温及瑞芬太尼均可明显减少COX-2产生，且联合应用后减少更加明显。上述结果表明亚低温和瑞芬太尼心肌保护作用可能与减少COX-2的产生相关。

亚低温和瑞芬太尼对家兔心肺复苏后心功能发挥保护作用的机制既具有共性，又不尽相同而互为补充。瑞芬太尼和亚低温可以发挥自由基清除的作用，但心肌缺血缺氧进展较迅速，治疗窗相对狭窄，而亚低温可以通过抑制心肌细胞凋亡，延长细胞凋亡的发生［13］。故两者联合治疗的可能机制是利用亚低温延长治疗时间窗，更加有效发挥瑞芬太尼和亚低温的自由基清除作用以及炎症反应抑制作用，从而达到理想的心肌保护目的。本研究结果显示，亚低温联合瑞芬太尼在改善各指标方面均不同程度地优于两者单独治疗，初步证明亚低温联合瑞芬太尼对家兔心肺复苏后心肌具有保护作用，但其确切改善效果及机制有待进一步探讨。

本研究的不足在于样本偏少、所有实验动物均无基础心脏疾病、观察时间较短，没有对亚低温实验动物复温，未进一步验证亚低温和瑞芬太尼联用对肝肾功能的影响；此外，亚低温和瑞芬太尼潜在的其他心脏保护机制以及临床适应症都将有待于进一步研究。

［1］DEMIRGAN S，ERKALP K，SEVDI MS，et al.Cardiac condition during cooling and rewarming periods of therapeutic hypothermia after cardiopulmonary resuscitation［J］.BMC Anesthesiol，2014，18（14）：14-78.

［2］KRAMER-JOHANSEN J，EDELSON DP，LOSERT H，et al. Uniform reporting of measured quality of cardiopulmonary resuscitation（CPR）［J］.Resuscitation，2007，4（3）：406-417.

［3］POST H，SCHMITTOJD，STEENDIJK P，et al.Cardiac function during mild hypothermia in pigs：increased inotropy at the expense of diastolic dysfunction［J］.Acta Physiol（Oxf），2010，199（1）：43-52.

［4］RÓKA A，MELINDA KT，VÁSÁRHELYI B，et al.Elevated morphine concentrations in neonates treated with morphine and prolonged hypothermia for hypoxic ischemic encephalopathy［J］.Pediatrics，2008，121（4）：e844-e849.

［5］WONG GT，HUANG Z，JI S，et al.Remifentanil reduces the release of biochemical markers of myocardial damage after coronary artery bypass surgery：A randomized trial［J］.Cardiothorac Vasc Anesth，2010，24（5）：790-796.

［6］WONG GT，LI R，JIANG LL，et al.Remifentanil post-conditioning attenuates cardiac ischemia-reperfusion injury via j or d opioid receptor activation［J］.Acta Anaesthesiol Scand，2010，54（4）：510-518.

［7］HUH PW，BELAYEV L，ZHAO W，et al.Comparative neuroprotective efficacy of prolonged moderate intraischemic and postischemic hypothermia in focal cerebral ischemia［J］.Neurosurg，2000，92（1）：91-99.

［8］THORESEN M，HOBBS CE，WOOD T，et al.Cooling combined with immediate or delayed xenon inhalation provides equivalent long-term neuroprotection after neonatal hypoxia-ischemia［J］.Cereb Blood Flow Metab，2009，29（4）：707-714.

［9］JACOBSHAGEN C，PELSTER T，PAX A，et al.Effects of mild hypothermia on hemodynamics in cardiac arrest survivors and isolated failing human myocardium［J］.Clin Res Cardiol，2010，99（5）：267-276.

［10］MEYBOHM P，GRUENEWALD M，ALBRECHT M，et al. Hypothermia and postconditioning after cardiopulmonary resuscitation reduce cardiac dysfunction by modulating inflammation，apoptosis and remodeling［J］.PLoS One，2009，4（10）：e758-e758.

［11］YU CK，LI YH，WONG GT，et al.Remifentanil preconditioning confers delayed cardioprotection in the rat［J］.Br J Anaesth，2007，99（5）：632-638.

［12］朱涛，许军秀，徐明.充血性心力衰竭患者血清sICAM-1及白细胞膜黏附分子水平检测［J］.郑州大学学报：医学版，2013，48（2）：260-263.

［13］李银平，秦俭，范振兴，等.自主循环恢复后轻度低温对心室纤颤兔心功能和心肌结构的影响［J］.中国危重病急救医学，2011，23（12）：743-748.

（编辑 国 荣）

Protective effect of mild hypothermia combined withμ-opioidreceptor agonist on cardiac function after postresuscitation in rabbits

ZHANG Li-ping，LI Pei-jie，CAO Wen，ZHANG Zheng-yi，LUO Yan-nian
（ICU of the Second Hospital，Lanzhou University，Lanzhou 730030，China）

Objective To observe the effects of mild hypothermia combined withμ-opioid receptor agonist on postresuscitation myocardial dysfunction，and further explore the possible underlying mechanisms.Methods After setting up rabbit model of cardiopulmonary resuscitation，30 rabbits were randomly divided into five groups：shamoperation group（A），control group（B），mild hypothermia group（C），Remifentanil group（D），and mild hypothermia combined with Remifentanil group（E）.We observed the left ventricular end-diastolic pressure（LVEDP），left ventricular pressure rise and maximum fall rate（±dp/dtmax），serum concentrations of H-FABP and COX2.At 4 h after resuscitation，the animals were killed to observe the expression of ICAM-1 and evaluate cardiac function.Results ①Compared with those in A group，LVED and peak±dp/dtmax in the other four groups decreased significantly（P＜0.01）.LVED and peak±dp/dtmax increased significantly at 120 and 60 min of resuscitation in C，D and E groups compared with B group（P＜0.05）；but they decreased obviously in E group（P＜0.05）；there were no significant differences between C and D groups.②Compared with A group，serum HFABP and COX2 levels in the other four groups increased significantly（P＜0.01）.H-FABP and COX2 decreased more significantly in C，D and E groups than in B group（P＜0.05）；they increased markedly in E group（P＜0.05）at the same stage.③A large number of ICAM-1 positive cells could be seen in B group.Compared with B group，ICAM-1 positive cells decreased significantly in C and D groups after resuscitation（P＜0.05）.Compared with C and D groups，ICAM-1 positive cells decreased significantly in E group after resuscitation（P＜0.05）.Conclusion Mild hypothermia and Remifentanil afford a significant cardioprotective effect，especially when they are combined with each other.This synergic effect may be related to making Remifentanil and mild hypothermia more effective in eliminating free radicals and inhibiting inflammatory reactions by prolonging the therapeutic time window of mild hypothermia，thus achieving the effect of myocardial protection.

mild hypothermia；Remifentanil；resuscitation；cardiac function；COX2；H-FABP；ICAM-1

R587.1

A

10.7652/jdyxb201505007

2014-10-10

2015-04-06

甘肃省科技厅资助项目；甘肃省技术研究与开发专项计划资助项目（No.1105TCYA011）Supported by the Department of Science of Gansu Province and the Technology Research and Development Special Plan of Gansu Province（No.1105TCYA011）

李培杰.E-mail：lipeijielanzhou@hotmail.com

优先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150717.0857.002.html（2015-07-17）