中草药残渣好氧厌氧耦合发酵产甲烷特性研究

李文哲，李鹏飞，王明，丁清华（东北农业大学工程学院，哈尔滨150030）

中草药残渣好氧厌氧耦合发酵产甲烷特性研究

李文哲，李鹏飞，王明，丁清华
（东北农业大学工程学院，哈尔滨150030）

中草药残渣（Chinese herb-extraction residues，CHER）是一种不易被微生物利用的固体有机废弃物，厌氧消化时微生物降解的木质素会对纤维素形成物理屏蔽，阻碍微生物胞外酶水解催化作用。可见木质素降解是水解酸化首要步骤，木质素最初裂解需要分子氧存在，未经过好氧处理的木质素几乎不能在厌氧环境下被微生物降解。为此将厌氧发酵分成两相，即首先对CHER中温好氧水解产酸发酵，之后产甲烷发酵试验。结果表明，好氧水解发酵运行24 h时两相发酵累积甲烷产量达到最大值，VS产甲烷率为198 mL CH4g-1VS，最大日产甲烷量为696 mL CH4day-1，与单相发酵相比总甲烷产量提高30.3%。

中草药残渣（CHER）；厌氧消化；甲烷；两相发酵

中草药残渣（CHER）是一种固体有机废弃物，其年产量超过100万t[1]。CHER中富含糖类、甙类、葱酮、木质素、生物碱、靴质和粗蛋白等有机化合物，处理不当会对生态环境造成影响[2]。CHER也是一种能被厌氧微生物降解发酵利用的生物质资源。但CHER中中性洗涤纤维（NDF）约占50%[3]，由于木质素物理屏蔽作用[4-5]，阻碍微生物细胞胞外酶与纤维素、半纤维素接触，限制CHER中纤维素、半纤维素水解速率，导致厌氧发酵过程缓慢，VS产甲烷率较低。

可见木质素降解是水解酸化首要步骤，木质素最初裂解需要分子氧存在，未经好氧处理木质素不能在厌氧环境下被微生物降解[6-8]。现有研究多针对木质素降解与甲烷产率关系[9-10]，针对CHER好氧厌氧两相耦合发酵可行性与产甲烷效果的研究较少。因此，本试验将CHER的厌氧产甲烷发酵分成两相，评估好氧厌氧两相耦合发酵模式及不同好氧水解产酸发酵时间对CHER甲烷产率影响，为CHER资源化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 设备与装置

本试验中使用装置为好氧水解发酵反应瓶和自制厌氧发酵反应器，分别采用广口瓶和三角瓶作为主体反应器。厌氧发酵反应器选用橡胶塞封口，再用玻璃胶粘合。利用打孔器在橡胶塞中央钻一个圆孔，把玻璃三通管插入孔中后用玻璃胶密封。三通管一段由橡胶管连接收集气体的铝箔集气袋（1～2 L），另一端封闭作排气用。发酵过程在可控温恒温摇床中进行，摇床为厌氧发酵营造恒温环境，试验在中温无需机械搅拌环境下操作，恒温摇床温度设为（35±1）℃，转速为0 r·min-1。

1.2 材料及预处理

用于两相发酵的中草药残渣（CHER）取自黑龙江中医研究院，将几种不同配方中药残渣混合后运回实验室。其各项指标如表1所示，每个样品测量重复3次取平均值。105℃烘箱中烘干至恒重，粉碎为50～200目粉末备用。

表1 CHER与接种物各项指标Table 1 Characteristics of CHER and inoculum

本试验所用接种物取自东北农业大学农业生态环境与能源工程实验室产甲烷反应罐，该反应罐参数如下：罐总容积500 L；工作容积400 L；工作温度（35±1）℃；厌氧反应底物：单牛粪；流出液总固体浓度（TS）6%～8%；牛粪VS产甲烷率180～220 L·kg-1，取用时发酵液已发酵完全。其各项指标见表1，每个样品测量重复3次取平均值。

1.3 试验方案

好氧厌氧两相发酵试验分两部分，好氧水解酸化发酵试验与批式厌氧产甲烷发酵顺次运行。将好氧水解发酵时间长度设置为影响因子，设置3个水平，分别为16 h（A组）、24 h（B组）、32 h（C组）。另设置一组单相发酵对照试验，即好氧水解发酵时间为0 h。

A、B、C 3组试验中将粉碎CHER粉末分别加入3个2 L广口瓶中，添加在35℃条件下发酵完全牛粪沼液作为接种物使料液TS为10%。搅拌均匀后中温35℃条件下水解预发酵。发酵过程中保证空气流通，并采用人工搅拌设备对料液每小时搅拌一次，每次搅拌持续5 min。待倒计时结束后，将水解发酵后的底物分别加入工作体积为0.7 L发酵瓶，再次加入牛粪沼液接种物使其TS为8%。水解发酵0 h对照试验，直接加入牛粪沼液接种物将CHER粉末配制成TS为8%发酵液并加入0.7 L发酵瓶中。全部装瓶密封完成后进行厌氧发酵相试验。该阶段试验在35℃恒温水槽中运行，测量每日产气量与甲烷纯度，直至发酵过程结束。试验中每个时间梯度平行3次，共12组。

表2 试验运行方案Table 2 Experimentaloperation scheme

1.4 测定项目及方法

使用装备不锈钢柱（1.5 m×3 mm i.d.carbon molecular sieve TDX-01:1.5～2.0 nm）和热导检测器（TCD）的气相色谱仪（GC-6890N，Agilent Inc.，USA）测定混合气体中甲烷与CO2含量。注射器、箱、探测器温度分别为120、190和220℃。载气为氩气，流速为40 mL·min-1。

总固体含量（TS）、挥发性固体含量（VS）、pH（Sartorius basic pH meter PB-10，Germany）使用标准方法测定。中性洗涤纤维（NDF）使用Goering和Van Soest描述的方法测定。所有测定平行3次，数值取3次平均值。

2 结果与分析

2.1 好氧水解酸化过程中物料pH变化

水解微生物分泌水解酶，例如纤维素酶、纤维二糖酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白质酶。发酵底物中复杂聚合物和大分子单体的最初裂解过程在水解微生物酶作用下完成，这一过程主要产物是一些还原糖、肽、长链脂肪酸等可被微生物直接利用的小分子有机物。纤维素、半纤维素、脂肪以及木质素等不溶解大分子有机物的初始裂解非常缓慢，一般需要几天时间才能水解为单体，而可溶解碳水化合物则在短短几小时内即完成此过程。

在好氧水解酸化发酵阶段，在水解微生物的作用下料液中还原糖、有机酸等小分子化合物含量上升，而在好氧环境中产甲烷微生物活性受抑制无法利用这些小分子。还原糖和有机酸在料液中不断累积，导致好氧发酵液的pH下降。最初料液在经过不同时长好氧水解酸化发酵后pH变化如图1所示。

可以看出，随着好氧水解发酵时间延长，料液pH呈明显下降趋势，pH从最初6.68下降到5.97。说明在好氧水解酸化发酵阶段，CHER中大分子有机物被成功分解为小分子还原糖和有机酸。从水解酸化发酵开始到水解酸化16 h，pH下降最为显著，下降值在0.5，说明接种物中水解酸化细菌具有良好活性；从水解酸化发酵16到24 h过程pH下降幅度较小，因为在这8 h内料液中水解酸化发酵速率下降，料液中水解酸化产物抑制水解酸化细菌活性，使水解酸化速率降低；在好氧水解酸化发酵最后8 h内，pH变化幅度很小，原因是水解产物进一步抑制水解酸化菌活性，料液中好氧水解酸化发酵已趋于平衡。

2.2 CHER单相厌氧发酵结果与分析

中草药残渣（CHER）单相厌氧发酵即对照组（好氧水解发酵时长为0 h）试验结果如图2、3所示，累积甲烷产量与VS甲烷产率分别为2 785 mL与151.1 mL CH4·g-1VS，试验结果为3次平行试验平均值。分析CHER成分可知，粗脂肪含量（TF）占TS的2.7%，挥发性固体含量（VS）为43.8%，而由于较高总纤维（NDF）含量以及木质素的物理屏蔽作用导致CHER累积甲烷产率和VS甲烷产率均较低。单相厌氧发酵试验（对照组）在第12天结束，累积产气量达到最高值。

图2 不同好氧水解发酵时间条件下累积甲烷产量Fig.2 Accumulation methane production atdifferenttime ofaerobic hydrolysis fermentation

图3 不同水解预处理时间条件下的VS产甲烷率Fig.3 VS methane yield at differenttime of aerobic hydrolysis fermentation

2.3 耦合发酵对CHER产气量影响

3个好氧水解发酵水平以及对照组累积甲烷产量如图2所示。A、B、C 3组甲烷总产量明显高于对照组。其中好氧水解发酵24 h（B组）的累积甲烷产量在厌氧发酵第12天达到最高3 780 mL，相对于对照组提升30.3%。说明经过耦合发酵后CHER产甲烷能力显著提升。如图3所示，4个不同好氧水解发酵时间条件下CHER批式厌氧发酵VS产甲烷率均值分别为151.1、160.7、198.1和191.9 mL CH4·g-1VS。由图1可知，经过耦合发酵后A、B、C 3组VS产甲烷率明显高于未经耦合发酵对照组；好氧水解发酵为24 h（B组）与32 h（C组）VS产甲烷率又明显高于好氧水解发酵16 h（A组）；而好氧水解发酵24与32 h的VS产甲烷率十分接近，分别为198.1 mL CH4·g-1VS与191.9 mL CH4·g-1VS。

Wang等研究表明CHER的VS产气率大概在140 mL CH4·g-1VS到200 mL CH4·g-1VS之间，不同种类CHER厌氧发酵的VS产甲烷率差别较大[3]。本试验为验证结果准确性，混合多种中药渣粉碎，试验结果基本符合以往结论。

好氧厌氧两相耦合发酵的CHER其VS产甲烷率明显高于单相批式厌氧发酵的CHER，这是因为好氧水解酸化发酵过程在水解细菌、酸化菌作用下不溶性有机物水解为溶解性有机物，大分子物质转化为易生物降解小分子物质，从而改善底物可生化性。对于中性洗涤纤维含量较高CHER而言，好氧水解发酵过程中木质素大分子链发生氧化断裂，由于木质素外围保护而无法被微生物胞外酶分解的纤维素、半纤维素直接被微生物溶解[10]，一部分纤维素、半纤维素被水解为纤维二糖、葡萄糖等能够溶于水并穿透细胞膜被细菌直接利用的小分子，提升底物中还原糖与乳酸含量，为后续产氢产酸阶段以及产甲烷阶段提供充分有利条件，从而大幅提升VS产甲烷率。

经耦合发酵的3组批式厌氧发酵中，B组与C组VS产甲烷率远高于A组。当好氧水解发酵16 h时，料液中水解酸化过程还在继续，针对木质素、纤维素以及半纤维素等大分子水解还不够彻底。而好氧水解发酵24与32 h的VS产甲烷率十分接近，均达到最高值。分析这一试验结果可知，底物料液好氧水解发酵24 h后，已达到水解酸化发酵终点，好氧水解细菌已停止工作。此时好氧厌氧耦合发酵第一阶段完成，亟需一个严格厌氧的环境进行后续产甲烷相发酵。而再延长水解时间到32 h，底物料液中大分子（纤维素、半纤维素等）不再被水解。综上所述，好氧厌氧耦合发酵能够显著提升CHER的VS产甲烷率，其中好氧水解酸化相运行时间以24 h为宜。

2.4 不同好氧水解发酵时间对产甲烷高峰影响

如图4所示，经好氧水解发酵16、24和32 h的CHER批式厌氧发酵产甲烷峰值分别出现在第4、第5和第6天，三条曲线变化幅度较大，日产甲烷高峰值分别为523、656和698 mL。单相批式厌氧发酵CHER日产甲烷曲线呈平缓下降趋势，在厌氧发酵第2天日产甲烷量达到峰值458 mL，在第12天到达批式发酵终点。好氧水解发酵16和24 h的CHER在第13天结束批式发酵，好氧水解发酵32 h CHER则在第15天完成发酵。

显而易见，CHER厌氧发酵产甲烷高峰期随好氧水解发酵时间延长而推迟，发酵周期也随之延长。这是因为好氧水解发酵时CHER与接种物混合料液一直处在有氧环境，料液中包括产乙酸菌、产甲烷菌在内厌氧菌受抑制无法增长繁殖，好氧水解发酵时间越长厌氧菌活性越低。好氧水解发酵阶段结束后，虽有二次接种过程，但接种量较少（TS接种比约为1∶3），而对照组的CHER接种量较高（TS接种比约为2∶1），原因为对照组单相厌氧发酵CHER启动速度快、周期短。在A、B、C 3组中，经一定时间增长繁殖后厌氧菌的菌群数量足够多，开始迅速降解利用水解阶段堆积的还原糖、乳酸等小分子有机物，使厌氧发酵甲烷产量达到高峰。同时，四组CHER厌氧发酵日产甲烷最大值，也随水解预处理时间延长而上升，水解预处理24和32 h的产甲烷峰值分别达到696和698 mL·day-1，远高于16和0 h的组分。这是由于好氧水解发酵24和32 h底物料液中积累的还原糖、乳酸等小分子含量较高。可见好氧水解发酵相运行24 h为最优选择。

图4 厌氧发酵日产甲烷量明细Fig.4 Methane daily yield ofanaerobic fermentation

2.5 不同好氧水解发酵时间对TS降解率影响

TS降解率是评估厌氧发酵效率重要指标之一，厌氧发酵过程中底物有机物被微生物利用产沼气使有机成分被去除，厌氧发酵前后TS降解率直接说明微生物对底物利用效率。

由图5可见，CHER在不同好氧水解酸化发酵时长条件下厌氧发酵TS降解率，在0～24 h阶段均呈明显上升趋势，24～32 h阶段曲线略有下滑，CHER在好氧水解发酵24 h时达到最大TS降解率40.0%。

好氧厌氧耦合发酵对CHER的TS降解率有明显提升。在CHER好氧水解酸化发酵32 h时TS降解率有小幅下滑，可能是产甲烷微生物长时间在好氧环境中活性受到抑制，后期产甲烷效能降低导致TS降解率下降。0～24 h阶段CHER的TS降解率曲线随着好氧水解酸化发酵时间延长而上升，说明水解微生物有效破坏木质素物理屏蔽使纤维素、半纤维素被降解，证明好氧厌氧耦合发酵模式相对于单相厌氧发酵而言对CHER的TS降解效率提升较大。

图5 不同好氧水解发酵时长条件下TS降解率变化Fig.5 Changes of TS degradation rate in different hydrolysis aerobic fermentation time

3 讨论

本文主要针对好氧厌氧两相耦合发酵模式可行性展开研究，好氧水解发酵为木质素有氧裂解，复杂大分子非溶解性聚合物被微生物转化为短链溶解性单体或二聚体的过程。高分子有机物因相对分子量巨大，不能透过细胞膜，因此不可能为微生物细菌直接利用。在水解阶段被细菌胞外酶分解为小分子。例如，纤维素被纤维素酶水解为纤维二糖与葡萄糖，淀粉被淀粉酶分解为麦芽糖和葡萄糖，蛋白质被蛋白质酶水解为短肽与氨基酸等。这些小分子水解产物能够溶解于水并透过细胞膜为细菌利用。水解过程通常较缓慢，多种因素如温度、有机物组成、水解产物浓度等可能影响水解速度与程度。上述小分子化合物在酸化菌细胞内转化为更为简单化合物并分泌到细胞外。发酵细菌绝大多数是严格厌氧菌，但通常有约1%兼性厌氧菌存在于厌氧环境中，这些兼性厌氧菌能保护严格厌氧菌免受氧损害与抑制。这一阶段主要产物有挥发性脂肪酸、醇类、乳酸、二氧化碳、氢气、氨、硫化氢等，产物的组成取决于厌氧降解条件、底物种类和参与酸化微生物种群。

水解酸化相之后是厌氧产甲烷相。厌氧发酵过程的平衡需将两相反应速率控制在一定范围内，如水解酸化相运行太快，会导致酸浓度上升pH下降到7.0以下，抑制产甲烷菌的活性；如产甲烷相运行太快，甲烷产量会被水解酸化相反限制。纤维素、半纤维素、脂肪以及木质素等不溶解大分子有机物的初始裂解缓慢，一般需几天时间才能被水解为单体，而可溶解碳水化合物则可在短短几小时内就完成此过程。因此，厌氧发酵过程中的限速步骤取决于底物中有机物成份。木质素、纤维素含量较高的生物质材料如农作物秸秆、中草药残渣等，水解酸化阶段会成为其厌氧发酵限速步骤，而对于可溶性碳水化合物含量较高生物质材料，产甲烷阶段会成为厌氧发酵限速步骤。为实现一个完整高效发酵过程，好氧厌氧两相各自运行时间必须控制在合理范围内[11-12]。

好氧厌氧两相耦合发酵意义在于可人为掌控水解酸化阶段和产甲烷阶段时长，将厌氧发酵两阶段运行控制在最佳速率从而提高产气率。一方面，对于中性洗涤纤维含量较高的生物质材料诸如CHER，水解阶段会成为厌氧发酵限速阶段，在对其单相发酵时，发酵体系中水解过于缓慢，产氢产乙酸细菌由于底物不足活性被抑制，导致整个发酵系统不活跃；另一方面CHER中木质素会对微生物形成物理屏蔽，使微生物不能直接接触纤维素与半纤维素，而木质素裂解需要在有氧环境中进行。所以考虑将CHER厌氧发酵分成两相，即首先对CHER中温好氧水解产酸发酵，之后产甲烷发酵，达到提高甲烷产率目的。

试验结果表明，相对于传统单相厌氧发酵，好氧厌氧耦合发酵模式对CHER的VS甲烷产率有较大提升，能有效降低木质素对纤维素的物理屏蔽作用，好氧厌氧耦合发酵模式也能应用于其他含较多木质素、纤维素以及半纤维素固体有机废弃物（如作物秸秆、林业废弃物等）厌氧发酵过程。

另外CHER处理可以考虑与其他底物结合进行混合厌氧发酵。因为CHER的中性洗涤纤维（NDF）含量在50%，用于单独厌氧发酵的甲烷产率较低，并且在中草药生产过程中经水提取，其内无机盐等物质流失较严重，导致其对pH缓冲能力较弱。可考虑与其他适合生物质材料，如市政污泥、牛粪等混合厌氧发酵。本试验在发酵前预先将CHER粉碎，以便于在实验室条件下进行研究。考虑到实际沼气生产中CHER预先粉碎成本过高，建议在大型沼气工程处理中草药残渣时适当延长好氧水解酸化发酵时间。

4 结论

a.好氧厌氧两相耦合发酵对改善CHER产甲烷潜能、提高甲烷产率效果显著，相对于单相CHER批式厌氧发酵累积甲烷产量最大提升幅度为30.3%。

b.不同好氧水解发酵时长对CHER产甲烷能力提升差别显著，本试验中好氧水解发酵24 h时，后续产甲烷发酵持续运行13 d，累积甲烷产量达到3 780 mL，VS产甲烷率为198 mL CH4·g-1VS，最大日产甲烷量为696 mL CH4，为最佳好氧水解发酵时长。

c.随好氧水解发酵相时间延长，后续厌氧产甲烷发酵相启动时间越长，产气高峰期越滞后。

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Study on characteristics of methane production by coupling aerobic and anaerobic fermentation of Chinese herb-extraction residues

LI Wenzhe,LI Pengfei,WANG Ming,DING Qinghua

(School of Engineering,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Lignocellulosic wastes such as Chinese herb-extraction residues(CHER)are not easily utilized by microorganisms owing to their physical shielding of cellulose and hinder microbial extracellular enzyme hydrolytic catalysis imparted by the non-digestible lignin.Obviously,degradation of lignin was the primary step of hydrolysis acidification.Lignin initial cleavage required the presence of molecular oxygen, without aerobic treatment lignin hardly degraded by microbes in anaerobic environment.Therefore, conducted anaerobic fermentation of CHER into two phase,that was per mesophilic aerobic hydrolysis fermentation before the methanogenic fermentation.The results showed that the maximum cumulative methane production,the methane yield was 198 mL CH4g-1VS and the maximum methane daily yield was 697 mL CH4day-1when the mesophilic aerobic hydrolysis fermentation phase run 24 h,and a 30.3%total methane yield enhancementcompare with single phase fermentation.

Chinese herb-extraction residues(CHER);anaerobic digestion;methane;two-phase fermentation

S216.4

A

1005-9369（2015）10-0090-07

时间2015-10-29 13:40:58[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151029.1340.012.html

李文哲,李鹏飞,王明,等.中草药残渣好氧厌氧耦合发酵产甲烷特性研究[J].东北农业大学学报,2015,46(10):90-96.

LiWenzhe,LiPengfei,Wang Ming,etal.Study on characteristics ofmethane production by coupling aerobic and anaerobic fermentation of Chinese herb-extraction residues[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(10):90-96.(in Chinese with English abstract)

2015-02-11

“十二五”国家科技支撑计划项目（2014BAD02B04）

李文哲（1955-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为生物质能源与利用。E-mail:liwenzhe9@163.com