应用高效液相色谱法测定清热利胆合剂中绿原酸的含量分析

陈 瑾

(四川省医学科学院·四川省人民医院药剂科，四川 成都 610072)

应用高效液相色谱法测定清热利胆合剂中绿原酸的含量分析

陈 瑾

(四川省医学科学院·四川省人民医院药剂科，四川 成都 610072)

目的 评价高效液相色谱(HPLC)法测定清热利胆合剂中绿原酸含量的效果。方法 采用HPLC法对4个清热利胆合剂样品(批号：140109、140412、140609、140714)中绿原酸的含量进行测定。结果 绿原酸进样量在220.4～2204 ng有良好的线性关系(r=0.9999)；平均回收率为99.63%，RSD为0.78%。结论 HPLC法测定清热利胆合剂中绿原酸的含量简便快速，结果准确、可靠，可用于该制剂的质量控制。

清热利胆合剂；绿原酸；高效液相色谱法

清热利胆合剂为本院自制制剂(川药制字Z20080172)，主要由忍冬藤、茵陈、金钱草、郁金和大黄等中药组成，具有清热、利胆的作用，临床用于胆囊炎的治疗。绿原酸为忍冬藤和金钱草中的主要成分，具有抗菌、抗病毒等功效[1]。为控制本品的内在质量，本实验选择绿原酸为质控指标，采用HPLC法进行测定，有利于其临床疗效的稳定性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 LC-20AD型高效液相色谱仪(日本岛津)，配备LC-20AD泵，SIL-20A型自动进样器，和SPD-M20A型二极管阵列检测器(190～800 nm)；AUW 220D型双量程分析天平(日本岛津，感量：0.1 mg/0.01 mg)。绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-200413，供含量测定用)；清热利胆合剂(医院自制，批号：140109、140412、140609、140714)；甲醇为色谱纯HPLC专用试剂，其他试剂为分析纯，水为纯化水。

1.2 方法 ①对照品溶液的制备：精密称取经60 ℃干燥至恒重的绿原酸对照品约10 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。②供试品溶液的制备：精密量取本品1 ml，置25 ml棕色量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。③阴性对照溶液的制备：另取处方量药品(除忍冬藤和金钱草外)，按质量标准规定工艺制成阴性对照制剂，按②项下方法制成阴性对照溶液。④色谱条件和系统适用性试验：色谱柱：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：以乙腈-0.4%磷酸溶液为流动相，按表1中的方法进行梯度洗脱；流速1 ml/min；检测波长328 nm，柱温40 ℃；进样量10 μl；理论板数按绿原酸峰计算不低于1000。⑤空白干扰试验：分别精密量取绿原酸对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定。⑥线性关系：精密称取干燥至恒重的绿原酸对照品11.02 mg，置50 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备液1.0、2.0、3.0、5.0 ml，分别置10 ml棕色量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得系列对照品溶液。分别精密量取上述4种浓度溶液和对照品储备液各10 μl注入液相色谱仪，按第④项色谱条件进行测定。以绿原酸峰面积(Y)对浓度(X， μg/ml)绘制标准曲线并计算回归方程。⑦重复性试验：取同一批清热利胆合剂(批号：140609)，按第②项下制备方法平行制备6份供试品溶液，按第④项色谱条件进行测定。⑧中间精密度试验：分别在不同的日期，用不同的分析仪器(美国安捷伦1100型HPLC仪)，由不同的分析人员按第②项下方法分别配制3份供试品溶液，按照第④项色谱条件测定。⑨供试品溶液的稳定性试验：取第⑦项下的供试品溶液1份，于室温(20～25 ℃)下放置，在不同时间段(0、2、4、6、8、10 h)分别进样。⑩加样回收率试验：精密量取9份已知含量的同一批号供试品溶液(批号：140609，含量为1.19 mg/ml)25 ml，分别置50 ml棕色量瓶中，分别精密加入绿原酸对照品溶液(浓度为0.241 mg/ml)4、5、6 ml，每个浓度平行三份，混合均匀后制成含绿原酸80%、100%及120%的样品溶液，再按第②项下方法制备供试品溶液。分别精密量取上述供试品溶液各10 μl，按④项色谱条件测定。

表1 梯度洗脱程序

2 结果

2.1 空白干扰试验 见图1。供试品溶液色谱图中有与对照品溶液色谱图中绿原酸色谱峰相对应的色谱峰，并且该色谱峰与其他色谱峰的分离度大于1.5，阴性对照溶液在与绿原酸对照品色谱峰相同保留时间处无色谱峰，即其它药材对绿原酸的含量测定无影响。

图1 绿原酸含量测定HPLC色谱图 a：对照品溶液；b：供试品溶液；c：阴性对照溶液；1：绿原酸峰

2.2 线性关系 线性回归曲线：Y=28213X + 20828(r=0.9999)。结果表明，绿原酸进样量在220.4～2204 ng线性关系良好。

2.3 重复性 样品中绿原酸的平均含量为1.19 mg/ml，RSD为0.44%。

2.4 中间精密度试验 绿原酸的平均含量为1.19 mg/ml，RSD为0.56%。

2.5 供试品溶液的稳定性试验 绿原酸峰面积的RSD为0.61%，表明供试品溶液于室温放置10 h内含量稳定。

2.6 加样回收率试验 绿原酸的平均回收率为99.63%，RSD为0.78%(n=9)，见表2。

表2 绿原酸加样回收率试验结果 (n=9)

2.7 绿原酸含量 取不同批号的清热利胆合剂，按第②项下制备方法制备并测定绿原酸含量，见表3。

表3 样品绿原酸含量测定结果 (n=3)

3 讨论

本研究选择绿原酸为主要质控指标，对清热利胆合剂的质量进行控制，为其临床疗效的稳定性提供参考。文献报道关于绿原酸的HPLC含量测定方法，多采用等度洗脱法，如乙腈-水-甲酸(9∶91∶0.1)[2]，乙腈-0.05%磷酸(10∶90)[3]。由于合剂中所含药材种类较多，成分复杂，采用常规等度洗脱方法不能将绿原酸与其他成分进行有效分离。我们采用乙腈-0.04%磷酸溶液梯度洗脱，主要成分均可在30 min内出峰，绿原酸色谱峰形较好，且与合剂中其他成分分离良好。本研究所建立的方法操作简单，结果准确可靠，可用于清热利胆合剂的质量控制，同时也可为类似的其他制剂中绿原酸的含量测定提供借鉴。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2010：179.

[2] 胡志国，王远兴，陈振桂，等.反相高效液相色谱法测定山楂中绿原酸的含量[J].食品科学，2007，28(11)：407-410.

[3] 曹金枝，苏志刚.HPLC法测定复方鱼腥草片中绿原酸的含量[J].首都医药，2014，20：93-94.

HPLC determination of chlorogenic acid content in Qingre Lidan Mixture

CHEN-Jin

(Department of Pharmacy，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To investigate the efficacy of HPLC method in determination of chlorogenic acid content in Qingre Lidan Mixture.Methods The contents of chlorogenic acid in four samples(Lot.140109，140412，140609 and 140714)of Qingre Lidan Mixture were measured by a HPLC method.Results The chlorogenic acid injection volume of 220.4～2204 ng had a fine linear relationship(r=0.9997).The rate of average recovery was 99.63% and RSD was 0.78%.Conclusion This method is proved to be simple and rapid.The result is accurate and reliable.It is suitable for the quality control of Qingre Lidan Mixture.

Qingre Lidan Mixture；Chlorogenic acid；HPLC

R284.1

A

1672-6170(2015)05-0139-03

2014-11-25；

2015-06-30)