不同浓度帕瑞昔布钠预处理对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤保护作用的研究

温开兰，杨孟昌，刘少星，谢先丰

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院麻醉科，四川 成都 610072；2.成都市第二人民医院麻醉科，四川 成都 610017)

不同浓度帕瑞昔布钠预处理对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤保护作用的研究

温开兰1，杨孟昌1，刘少星2，谢先丰2

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院麻醉科，四川 成都 610072；2.成都市第二人民医院麻醉科，四川 成都 610017)

目的 探讨不同浓度帕瑞昔布钠预处理对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用。方法 雄性SD大鼠128只，采用随机数字表法分为假手术组(S组)、单纯缺血再灌注组(I/R组)、缺血再灌注+帕瑞昔布预处理组(P1、P2、P3、P4、P5、P6组)共8组，每组16只大鼠。线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO)，缺血后2 h后再灌注24 h。在缺血前30 min，P1～P6组分别经颈内静脉注入2、4、6、8、10、20 mg/kg帕瑞昔布钠；S组和I/R组分别注入等容积生理盐水。比较各组缺血2 h及再灌注24 h行神经功能缺失评分、脑梗死体积及体积百分比、缺血侧额区皮质中前列腺素E2(PGE2)含量。结果 P1～P6组神经功能缺失评分、缺血再灌注后脑梗死体积、梗死体积百分比及PGE2含量均高于S组，但低于I/R组，差异均有统计学意义(P< 0.05)。随帕瑞昔布钠浓度升高，P1～P6组神经功能缺陷评分、脑梗死体积、脑梗死体积百分比及缺血侧额区皮质PGE2含量均逐渐降低，差异有统计学意义(均P< 0.05)。结论 帕瑞昔布预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用，20 mg/kg保护作用最强。

帕瑞昔布；缺血-再灌注损伤；PGE2；预处理

缺血性脑血管病(ischemic cerebral vesscular disease，ICVD)致死率极高，是目前重点防治的一种疾病。在ICVD中，脑损伤持续发展，且缺血后炎症反应与延迟性脑损伤关系密切。帕瑞昔布为新型非甾体类药物，是目前供临床应用的唯一注射用高选择性环氧合酶2(COX-2)抑制剂，临床上主要用来降低术后疼痛。治疗浓度的帕瑞昔布可选择性地抑制COX-2，抑制前列腺素类的合成，通过抑制脑缺血再灌注损伤中的免疫炎症反应途径而发挥脑保护作用[1，2]。发挥镇痛和抗炎作用时对COX-1抑制作用并不明显，因而在发挥镇痛及抗炎作用的同时，不影响胃黏膜、血小板及肾脏的功能。本研究利用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO)，观察不同浓度帕瑞昔布对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的影响，探讨帕瑞昔布发挥最大保护效应的最适浓度，为临床应用研究提供实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠128只，SPF级，体重250～300 g，由四川省人民医院动物中心提供。使用随机数字表将其分为假手术组(S组)、单纯缺血再灌注组(I/R组)、缺血再灌注+帕瑞昔布预处理组(P1、P2、P3、P4、P5、P6组)共8组，每组16只大鼠。

1.2 药品、试剂及实验仪器 帕瑞昔布(商品名：特耐)批号：85820004，辉瑞制药有限公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)：上海医药集团上海化学试剂公司；Sn-695B型免疫计数器，上海核所日环光电仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MCAO 再灌注模型制备 参考Longa等文献[1]，实验开始前1 h行Longa神经功能缺失评分，排除自身神经功能缺陷大鼠。线栓法制作大鼠MCAO 再灌注模型。腹腔注射10%水合氯醛麻醉，对鼠气管插管后仰卧固定，分别游离出右侧颈总动脉及颈内、颈外动脉及左颈总静脉，线栓(直径0.23 mm，长度5 cm)经颈外动脉进入通过颈内动脉插入大脑中动脉。进线栓长度为距颈总动脉分叉处18～20 mm，S组进线栓深度为10 mm。栓塞成功的大鼠(参考Longa等的5分评分法评分，2分及以上者入选本实验)在缺血后2 h再次麻醉后拔线栓至颈外动脉残端行再灌注。术中采用恒温箱维持老鼠肛温在36.5～37.0 ℃。术中插线栓次数大于3次、出血较多、取脑时发现蛛网膜下腔出血及再灌注时间不足24小时死亡者剔除，并补足相应例数。P1～P6组在缺血30分钟前分别经颈内静脉向向心端注入2、4、6、8、10、20 mg/kg帕瑞昔布注射液，而S组及I/R组给予等容积生理盐水。

1.3.2 神经行为学检查 于缺血2小时和拔出线栓行再灌注24小时进行神经行为学检查，按照Longa等5分制评分标准进行评分：无神经功能缺损为0分；不能完全伸展左侧前爪为1分；向左侧转圈为2分；：行走时向左侧倾斜为3分；不能自发行走，有意识障碍为4分。

1.3.3 脑梗死体积测定 于再灌注24 h每组取8只大鼠，麻醉下迅速断头取脑组织，去除嗅球、小脑及低位脑干后，于-20 ℃冰箱中保存，行连续冠状切片5片，片厚约2 mm，置于1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑(上海医药集团上海化学试剂公司)磷酸缓冲液中，37 ℃下避光孵育20 min，正常脑组织染成红色，梗死区呈白色，置4%多聚甲醛固定，相同条件下拍照，病理图像使用Image Pro Plus图像分析软件(Media Cybernetics公司，美国)行分析，测定脑梗死体积和脑梗死体积百分比。

1.3.4 前列腺素E2(PGE2)含量的测定 各组中剩余大鼠于再灌注24 h再次麻醉后迅速断头取脑，取视交叉至漏斗柄脑片置10%甲醛溶液中固定48 h，常规石蜡包埋，冠状切片(5 μm)。HE染色后观察海马CA1区病理变化。同时在冰皿上迅速剥离右侧大脑额区皮质，精确称重，以冷PBS制成25%脑组织匀浆，-70 ℃冻存。冰浴中孵化，置于1.5 ml离心管中，4 ℃、3000 rpm离心20 min取上清液，按ELISA试剂盒说明书测定脑组织中PGE2水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析；相关性分析采用Pearson分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组缺血再灌注不同时点神经功能缺失评分 I/R组、P1～P6组神经功能缺陷评分均高于S组(P< 0.05)；且P1～P6组低于I/R组，差异有统计学意义(P< 0.05)见表1。随帕瑞昔布钠浓度升高，P1～P6组神经功能缺陷评分逐渐降低，呈负相关(r=-0.613，P< 0.05)。

2.2 各组脑梗死体积、梗死体积百分比及再灌注24 h缺血侧额区皮质PGE2水平 I/R组、P1～P6组脑梗死体积及脑梗死体积百分比及缺血侧额区皮质PGE2含量均高于S组，差异有统计学意义(P< 0.05)；且 P1～P6组低于I/R组，差异有统计学意义(P< 0.05)，见表1。随帕瑞昔布钠浓度升高，P1～P6组脑梗死体积、脑梗死体积百分比及缺血侧额区皮质PGE2含量均逐渐降低，呈负相关(r=-0.875；r=-0.763；r=-0.687，均P< 0.05)。

3 讨论

结合我们的前期研究以及相关文献，已经证实了帕瑞昔布的良好镇痛作用以及其帕瑞昔布钠预处理对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤有保护作用：其保护作用从2 mg/kg开始出现，但在其浓度大于20 mg/kg之后可增大心血管系统及胃肠黏膜相关并发症的风险，而在此浓度范围内尚未观察到不良反应，故本研究在此范围观察比较不同浓度的保护作用[2～5]。

表1 各组大鼠缺血再灌注各观察指标的比较

*与S组比较，P< 0.05；#与I/R组比较，P< 0.05；△与P1组比较，P< 0.05

在脑缺血再灌注损伤导致的免疫炎症损伤的研究中，最新观点认为，白细胞浸润所致的炎性反应在脑缺血再灌注损伤的发生、发展中起重要作用。脑缺血再灌注损伤时，氧自由基等信使激活炎性细胞因子，使白细胞和血管内皮细胞表面的黏附分子表达上调，中性粒细胞向微血管内皮细胞移动和黏附，致使中性粒细胞在缺血脑组织中浸润引起损伤。研究显示，非甾体类抗炎药预处理可有效抑制脑缺血再灌注损伤中的炎症反应而起到一定的脑保护作用，关于其机制可能是通过抑制内皮黏附分子的表达减轻再灌注后炎症反应而减少脑梗死面积[6～8]。COX-2是炎症反应过程中的重要因子，抑制COX-2过度表达和/或激活是对多种炎症的有效治疗手段之一[9]。PGE2为花生四烯酸代谢途径中COX-2催化产物，为COX-2活性标志物之一。PGE2通过增加星形胶质细胞谷氨酸的释放介导神经毒性作用[10]。过度表达的TNF-α、IL-1β可以激活血管内皮细胞、细胞间黏附分子，使白细胞与血管内皮的黏附性增强，导致微血管迟发型低灌注并可诱导其它细胞因子的产生，促进兴奋性氨基酸，氧自由基等神经毒性物质的生成和释放，造成脑水肿，加重炎性损伤[11]。

在大鼠脑缺血再灌注之后，脑组织内的COX-2mRNA及COX-2蛋白含量明显增加，使用COX-2抑制剂可使大鼠局灶性脑缺血再灌注脑梗死体积明显缩小，并能通过抑制PGE2的增加，减少海马CA1区神经元迟发性坏死[12～14]。非甾体类抗炎药帕瑞昔布钠是全球第一种注射用高选择性COX-2抑制剂，目前广泛用于各类手术后疼痛的治疗，故本研究选用帕瑞昔布钠作为研究药物。

线栓法制备的大鼠局灶性脑缺血模型可模拟临床上常见的大脑中动脉供血区栓塞，因此本研究采用该方法制备脑缺血再灌注损伤模型。脑缺血2 h进行再灌注的方法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型，再灌注24 h时脑梗死体积较大，因此本研究以再灌注24 h作为观察时点。结果表明，与S组比较，I/R组神经功能缺失评分升高，且有脑梗死灶，提示脑缺血再灌注损伤模型制备成功。与I/R组比较，P1～P6组脑梗死体积及脑梗死体积百分比均降低，说明随着帕瑞昔布浓度升高，其保护作用更明显。本研究结果显示：再灌注24 h后，PGE2含量显著升高。帕瑞昔布预处理后脑组织中PGE2含量降低，且随着帕瑞昔布钠浓度升高预处理作用更明显。

综上所述，帕瑞昔布预处理能减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤，降低脑梗体积及体积百分比，改善神经功能，抑制炎性反应，减轻缺血再灌注损伤，且20 mg/ml保护作用最佳。

[1] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1)：84.

[2] 刘少星，刘丹彦，吴会生，等.帕瑞昔布钠预先给药对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响[J].中华麻醉学杂志，2010，30(8)：1009-1011.

[3] 蔡兵，杨孟昌，卢静，等.帕瑞昔布钠超前镇痛对胸科手术患者麻醉恢复期的影响[J].实用医院临床杂志，2012，9(6)：65-67.

[4] Cui WY，Yu X，Zhang HQ.The Study of Different Approaches of Parecoxib Sodium Pretreatment on the Behavior of Rats with Neuropathic Pain.[J].Cell Biochemistry & Biophysics，2015，72(1)：137-140.

[5] T.W.Kim，C.Vercelli，A.Briganti，et al.The pharmacokinetics and in vitro/ex vivo cyclooxygenase selectivity of parecoxib and its active metabolite valdecoxib in cats.[J].Veterinary Journal，2014，202：37-42.

[6] Candelario-jalil E，Gonzalez-Falcon A，Gareia-Cabrera M，et al.Post-ischemic treatment with the cyclooxygenase-2 inhibitor nimesulide reduces blood-brain barrier disruption and leukocyte infiltration following transient focal cerebral ischaemia in rats[J].J Neurochem，2007，100：1108-1120.

[7] Hamada T，Tsuchihashi S，Avanesyan A et al.Cyclooxygenase-2 deficiency enhances Th2 immune responses and impairs neutrophil recruitment in hepatic ischemia/reperfusion injury[J].Journal of Immunol，2008，180(3)：1843-1853.

[8] Jin WC.Treadmill exercise inhibits hippocampal apoptosis through enhancing N-methyl-D-aspartate receptor expression in the MK-801-induced schizophrenic mice[J].Journal of Exercise Rehabilitation，2014，10(4)：218-224.

[9] Minghetti L.Cyclooxygenase-2(COX-2)in inflammatory and degenerative brain diseases[J].Journal of Neuropathology & Experimental Neurology，2004，63(9)：901.

[10]Cai F，Li C，Wu J，et al.Modulation of the Oxidative Stress and Nuclear Factor κB Activation by Theaflavin 3，3’-gallate in the Rats Exposed to Cerebral Ischemia-Reperfusion[J].Folia Biologica(Praha)，2007，53：164-172.

[11]Nakayama M，Uchimura K，Zhu RL，et al.Cyclooxygenase-2 inhibition prevents delayed death of CA1 hippocampal neurons following global ischemia[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95(18)：10954.

[12]Takadera T，Yumoto H，Tozuka Y，et al.Prostaglandin E2 induces caspase-dependent apoptosis in rat cortical cells[J].Neuroscience letters，2002，317(2)：61-64.

[13]Dienel GA，Hertz L.Astrocytic contributions to bioenergetics of cerebral ischemia[J].Glia，2005，50(4)：362-388.

[14]Gabryel B，Abuzek K，Ma Ecki A，et al.Immunophilin ligands decrease release of pro-inflammatory cytokines(IL-1β，TNF-α and IL-2)in rat astrocyte cultures exposed to simulated ischemia in vitro[J].Polish journal of pharmacology，2004，56(1)：129-136.

The protection effect of pretreatment with different doses of parecoxib for focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

WEN Kai-lan1，YANG Meng-chang1，LIU Shao-xing2，XIE Xian-feng2

(1.Department of Anesthesiology，Sichuan Academy of Medical Science and Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China；2.Department of Anesthesiology，The 2ndPeople’s Hospital of Chengdu，Chengdu 610017，China)

YANGMeng-chang

Objective To investigate the protective effects of different concentration of parecoxib pretreatment on focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R)injury in rats.Methods One hundred and twenty eight male SD rats were randomly divided into sham operation group(group S)，simple focal cerebral I/R group(group I/R)and six focal cerebral I/R+ parecoxib pretreatment groups(group P1，P2，P3，P4 P5 and P6).Total were 8 groups，16 animals in each group.Rat middle cerebral artery ischemia model(MCAO)was set-up by using a suture-occluded method.Reperfusion was performed for 24 hours after 2 hour of ischemia.2，4，6，8，10，20 mg/kg of parecoxib were injected via inter jugular vein 30 min before ischemia in the groups P1～P6 while equal volume of saline was given in the group S and the group I/R.The neurological deficit scores(NDSs)were measured at 2 h after ischemia and at the end of 24 hours of reperfusion.The infarct volume and volume percentage were measured using TTC staining.Prostaglandin E2(PGE2)content in the ischemic frontal cortex was measured using a radioimmunoassay.Results The NDSs，the volume of cerebral infarcts and the percentage of cerebral infarcts，and the PGE2content in the groups P1～P6 were significantly higher than that in the group S but lower than that in the group I/R(all P < 0.05).These indexes were gradually decreased with the increasing doses of parecoxib when the group P1 to p6 were compared(allP< 0.05).Conclusion Pretreatment with parecoxib has protective effect on focal cerebral I/R injury in rats and it has strongest effect at 20 mg/kg.

Parecoxib；Ischemia-reperfusion injury；PGE2；Pretreatment

四川省卫生厅科研基金资助项目(编号：100520)

杨孟昌

R322.81

A

1672-6170(2015)05-0074-04

2015-03-11；

2015-07-12)