平菇-650液态发酵啤酒糟获取膳食纤维的培养基优化

肖连冬，程 爽

（南阳理工学院 生物与化学工程学院，南阳 473000）

膳食纤维被誉为“第七营养素”[1]，按溶解性不同可分为可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）两类，二者在人体内所具有的生理结构和保健作用不同，SDF在许多方面比IDF有更强的生理功能，如防治便秘、降低胆固醇等[2]。啤酒糟又叫麦糟，是一个宝贵的膳食纤维资源，但较低的SDF含量是其生理活性较低的原因所在，高品质膳食纤维的可溶性成分含量应该达到10%以上[3]。药食用真菌具有降解、转化植物细胞壁纤维组分的酶系统[4]，通过发酵，消耗原料中的碳源、氮源，以消除原料中的淀粉、蛋白质等成分，并通过对木质素、纤维素等不溶性膳食纤维的分解，使IDF转化为SDF，提高SDF的含量，同时生成菌体多糖、菌体纤维素，提高膳食纤维的生理活性和实用价值[5-6]。本研究以啤酒糟为原料，以平菇菌为膳食纤维生产的发酵菌株，采用液态发酵方式，通过研究辅料麸皮、豆渣、玉米粉的添加及配比对发酵制取膳食纤维品质的影响，优化出最佳培养基配方，提高其SDF含量，获得高品质的膳食纤维，为平菇液态发酵制取优质啤酒糟膳食纤维提供了一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌种

平菇-650（Pleurotus ostreatus-650）：南阳理工学院微生物实验室提供。

1.1.2 试验原料

啤酒糟（含水量8.74%）：南阳天冠啤酒有限公司；玉米粉（含水量15.11%）、麸皮（含水量4.09%）、豆渣（含水量19.78%）：市售。

1.1.3 培养基

菌种活化及平板培养采用马铃薯葡萄糖（potatodextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g。将马铃薯去皮，切块，煮沸30 min，纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1 000 mL。

种子培养基：玉米粉20g/L，酵母膏3g/L，KH2PO41.5g/L，蔗糖10 g/L，MgSO40.5 g/L。

发酵培养基：啤酒糟、麸皮、玉米粉、豆渣按一定比例配制。

1.2 仪器与设备

101A-2型电热鼓风干燥箱：上海申光仪器仪表有限公司；HZQ-B型恒温数显摇床：苏州威尔实验用品有限公司；SHB-3型循环水多用真空泵：上海精科仪器有限公司；PYXPHS-50型电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；SW-CJ-2G型双人净化工作台：苏州净化；LDZX-40Ⅱ型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；FW-100型粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；TDL-40B离心机：上海安亭科学仪器总厂；FA10004型电子天平：上海天平仪器厂；SHA-C恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；JA1003分析天平：上海良平仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试管母种的活化及平板培养

菌种活化在试管中进行，用灭菌的接种铲从原保藏斜面铲下菌块2块，接种到灭菌的试管斜面培养基上，在25℃恒温培养6～7 d，直到长满试管，再进行第二次转接活化，第二次活化培养时间约需4～5 d，根据菌种保藏时间的长短，一般需活化2～3次。然后将试管菌种转接在平板上，便于在接种种子液时，用打孔器准确取菌块用。平板在25℃恒温培养直至长满固体平面，挑选菌丝洁白、粗壮、浓密、无污染的菌种作为下一步的供试菌种。

1.3.2 测定生长曲线

取8个250 mL三角瓶，分别加入100 mL种子培养基，灭菌，冷却。用打孔器取生长良好的平板菌种，每个三角瓶接种4块，置于25℃转速120r/min的恒温振荡器上培养0～7d，每天取对应时间编号的三角瓶，离心（3 500 r/min，15 min）后测定平菇-650菌丝湿质量。以发酵时间为横坐标，菌丝湿质量为纵坐标，绘制生长曲线。

1.3.3 种子液的制备

在无菌条件下，用打孔器在长满菌丝体的培养基平板上取菌种块4块，接入装有100 mL培养基的250 mL三角瓶中，内装4颗玻璃珠避免菌丝成块，在转速120 r/min，25℃恒温振荡培养3.5 d，得到种子液，发酵备用。

1.3.4 啤酒糟膳食纤维发酵试验

将啤酒糟、麸皮、豆渣和玉米粉分别干燥，粉碎过40目筛后按一定比例混合，以料液比1∶10（g∶mL）加水，用250 mL三角瓶装100 mL发酵培养基，每瓶放入4枚洁净的玻璃珠，灭菌后接入10%摇瓶种子液，置于恒温振荡器中发酵（25℃，120 r/min，5 d），干燥即得活性膳食纤维产品。

1.3.5 可溶性膳食纤维含量测定[7-11]

取膳食纤维样品1.00 g，沸水浴糊化，加入淀粉酶、糖化酶，40℃酶解3 h后，冷却离心（3 500 r/min，15 min），加入4倍体积的体积分数95%乙醇沉淀约8h，离心得SDF沉淀，用无水乙醇洗涤离心2次，再加丙酮洗涤离心1次，真空干燥至质量恒定即为SDF。SDF得率计算公式如下：

1.3.6 单因素试验

以SDF得率为考察指标，在由啤酒糟、麸皮、豆渣和玉米粉组成的培养基中，分别通过改变麸皮、玉米粉和豆渣添加量，考察其对可溶性膳食纤维得率的影响，每次试验重复3次，结果取平均值。

1.3.7 膳食纤维发酵培养基优化方案设计

在单因素试验的基础上，设计L9（34）正交试验，综合考察麸皮含量、玉米粉含量和豆渣含量对啤酒糟膳食纤维SDF得率的综合影响。分析因素的主次顺序及影响显著性，优化培养基组成。

2 结果与分析

2.1 平菇-650生长曲线绘制

平菇-650生长曲线见图1。从图1可见，在该培养液中，平菇-650的生长显示了较为明显的4个时期，分别为迟缓期（0～1 d）、对数生长期（1～4 d）、稳定期（4～5 d）和衰亡期（5 d后）。微生物的移种时间一般选择对数期的中后期，此时菌种不仅活力强，且密度较大，综合考虑，种龄选取3.5 d较为合适。

图1 平菇-650生长曲线Fig.1 Growth curve ofPleurotus ostreatus-650

2.2 单因素试验

2.2.1 玉米粉添加量对可溶性膳食纤维得率的影响

图2 玉米粉含量对可溶性膳食纤维得率的影响Fig.2 Effect of corn flour content on soluble dietary fiber yield

在啤酒糟发酵培养基混合料中，麸皮和豆渣含量均定为3%，玉米粉含量分别选取0、2%、3%、4%、5%、6%，考察其对SDF得率的影响，发酵结果见图2。

玉米粉可以为菌种提供碳源、氮源及生长因子，添加一定量的玉米粉有利于菌种的生长代谢[12]。由图2可知，玉米粉添加量对发酵生产膳食纤维的品质影响较大。当玉米粉加量为2%时，SDF得率最高达15.14%，随玉米粉含量的继续增大SDF得率逐渐下降。基质中的碳氮比对真菌生长有一定的影响，在碳源相对充足的前提下，随着基质中氮元素量的增加，菌体产量会随之增加，但增加到一定程度后，产量增速下降，超过一定量后，产量增速极缓慢甚至呈现负增长。适当添加玉米粉能促进菌体的大量生长，对菌种产纤维素酶有利，生成更多的SDF，但玉米粉加量过高，会造成液体培养基粘度增加，碳氮比过大，不利于菌体的生长。故单因素试验选择玉米粉添加量为2%。

2.2.2 麸皮含量对可溶性膳食纤维得率的影响

啤酒糟培养基中添加麸皮，使麸皮含量分别为0、1%、2%、3%、4%、5%、6%，玉米粉和豆渣含量均为3%，考察其对SDF得率的影响，发酵结果见图3。

图3 麸皮含量对可溶性膳食纤维得率的影响Fig.3 Effect of wheat bran content on soluble dietary fiber yield

麸皮是食用真菌生长的很好氮源和生长因子，能明显促进菌种的繁殖和代谢。由图3可知，麸皮加量对发酵生产麦糟膳食纤维影响很大，在4%以下时，随着麸皮加量增加，SDF快速增加。在麸皮含量4%时，SDF得率达到最高15.3%，可能是因为麸皮促进了微生物的代谢和生物量的积累，而菌体内自身合成的微生物多糖也有助于SDF的提高[5，13]。继续增加麸皮量，SDF得率略降。故选择麸皮添加量为4%。

2.2.3 豆渣含量对可溶性膳食纤维得率的影响

在啤酒糟培养基中，玉米粉和麸皮含量均为3%，豆渣含量分别取0、1%、2%、3%、4%、5%、6%，考察其对SDF得率的影响，发酵结果见图4。

由图4可知，豆渣对发酵生产啤酒糟膳食纤维有影响，膳食纤维中SDF得率随培养基中豆渣含量的增加而呈现先升高后降低趋势，3%豆渣含量时更有利于SDF的生成，SDF得率达到最大。豆渣含有大量的氨基酸、矿物质和维生素，添加适量有利于菌体的生长代谢[14-15]，但过多也不利于SDF和IDF的积累。

图4 豆渣含量对可溶性膳食纤维得率的影响Fig.4 Effect of soybean dreg content on soluble dietary fiber yield

2.3 正交试验

在单因素试验的基础上，设计正交试验优化啤酒糟膳食纤维发酵培养基配方，综合考察麸皮含量、玉米粉含量和豆渣含量对麦糟膳食纤维SDF得率影响。试验结果及极差分析见表1，方差分析结果见表2。

表1 培养基配方优化正交试验结果与分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for medium components optimization

表2 正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment results

从表1极差分析结果可见，对SDF得率影响因素的主次顺序为B＞A＞C，最优组合为A2B1C2，即玉米粉2%，豆渣2%，麸皮4%。对试验结果进行方差分析，在选取的因素水平内，豆渣和玉米粉两因素对SDF得率影响均达到极显著水平，麸皮对SDF得率影响达显著水平，这与极差分析的结果一致。A2B1C2为正交表中所涵盖的试验，其SDF得率为15.64%。为验证结果可靠性，在最优组合条件下进行验证试验，试验进行3组，每组平行3个，取其平均值，SDF得率为15.71%，达到了正交试验的最优结果。

3 结论

采用平菇-650发酵啤酒糟生产高活性膳食纤维过程中，添加玉米粉、豆渣和麸皮可提高SDF的含量，使膳食纤维质量得以提高。试验优化得到的最佳培养基辅料添加组合为玉米粉2%，豆渣2%，麸皮4%。因此发酵培养基整体配方为啤酒糟92%、玉米粉2%、豆渣2%、麸皮4%，在该培养基组合条件下进行发酵生产膳食纤维，SDF得率可达到15.71%。试验结果为平菇液态发酵啤酒糟制取优质膳食纤维提供了一定参考。

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